Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung
1.3. Một số phương pháp xác định cloramphenicol
1.3.1.1. Phân tích bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao [28,36,38,40]:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp sắc ký lỏng chủ yếu được sử dụng để xác định cloramphenicol, đặc biệt là trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định cloramphenicol ở cấp độ siêu vết. Trên thế giới có rất nhiều các nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp này, trong đó pha tĩnh được sử dụng là pha tĩnh không phân cực C8 hoặc C18 [36,38]
Dung môi động có tính phân cực cao nhƣ: Hỗn hợp H2O/Acetonitril(75/25,v/v) hay hỗn hợp axit axetic 1% trong methanol/H2O (55/45,v/v). Tốc độ pha động 1ml/phút
(a)
(b)
Detectơ thường được sử dụng là UV-VIS ở bước sóng 278nm hay detectơ MS. Detectơ UV-VIS có độ nhạy không cao lắm (LOD khoảng 0,4 – 2 ng/g; trong khi với detectơ MS giá trị LOD có thể đạt đến 0,1ng/g. Các kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng trong MS như ion hóa ở áp suất thường (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) hay kỹ thuật phun ion hóa (Electrospray Ionization, ESI). Trong phương pháp LC/MS/MS, với kỹ thuật APCI, các mũi m/z đặc trƣng cho Cloramphenicol là 321, 152, 257 và 194; với kỹ thuật ESI cho các mũi 321, 257, 194, 176 và 152.
Phương pháp này thông thường được áp dụng để phân tích hàm lượng cloramphenicol trong thực phẩm. Đối với các đối tƣợng mẫu nhƣ trứng, mật ong sữa, tác giả Yanbin Lu [38] còn sử dụng thêm cột chiết pha rắn với ống cacbon đa vách làm chất hấp phụ trước khi mẫu được chạy qua cột sắc ký lỏng kết hợp detectơ khối phổ (HPLC/MS). Với cách làm này, ông đã hạ giới hạn phát hiện của cloramphenicol xuống là 0,004àg/kg, 0,003àg/kg và 0,003àg/L lần lƣợt với 3 đối tƣợng trứng, mật ong và sữa. Giới hạn định lƣợng thu đƣợc lần lƣợt là 0,012 àg/kg, 0,09 àg/kg và 0,08 àg/L. Hiệu suất thu hồi mẫu rất cao nằm trong khoảng 95,8%
đến 102,3%.
Về khía cạnh detectơ, nhóm tác giả Van der Lee và các cộng sự [36] đã sử dụng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để tách cloramphenicol và nhóm các dẫn xuất của nó sử dụng detectơ điện hóa thay vì detectơ UV thông thường. Pha tĩnh được sử dụng là cột C8 (MOS-Hypersil, 5àm), pha động là hỗn hợp axit pecloric:methanol 85:15 và natri 1-pentasulphonat 5.10-4M, tốc độ dòng là 2,2mL/phút. Kết quả thu được rất tốt với khoảng tuyến tớnh là 0,1àg/mL đến 1mg/mL tương đương 3.10-7M đến 3.10-3M, độ nhạy của phương pháp khá cao đạt 0,3nA/ng và giới hạn phát hiện là10ng/mL. Tác giả đã chứng minh số liệu thu đƣợc khi phân tích bằng hệ sắc ký lỏng sử dụng detectơ điện hóa này (là detectơ đo dòng sử dụng điện cực thủy ngân) có độ nhạy không kém gì detectơ UV thông thường.
1.3.1.2. Phân tích bằng sắc ký khí [16,22,30]
Điều kiện tiến hành phân tích: Pha tĩnh polysiloxan có độ phân cực từ thấp đến trung bình với tỷ lệ phenyl từ 5-50% (metyl 95-50%), pha động là khí N2, tốc đọ pha động: 1mL/phút, đầu dò thường được sử dụng là đầu dò ECD hay MS.
Các tác giả Allen P. Pfenning, Jose E. Roybal, heidi S. Rupp, Sherri B.
Turnipspeed, Steve A. Gonzales and Jeffrey A. Hurbut [16] đã thành công trong việc xác định đồng thời tồn dƣ của 4 loại kháng sinh trong đó có cloramphenicol trong tôm sử dụng sắc kí khí với detecto ECD. Chất nội chuẩn là meta- nitrochloramphenicol. Các chất đƣợc chiết ra khỏi tôm bằng dung môi etylaxetat và hỗn hợp của nó với acetonitril. Hai loại cột đƣợc sử dụng là cột C18 và cột polysunfonic với các pha động thích hợp. Giới hạn phát hiện đối với cloramphenicol là 0,7 ppb với hiệu suất thu hồi là 88%.
Khi dùng detecto MS, thường dùng kỹ thuật bắn phá ion (Electron Impact, EI), hay ion hóa học âm (Negative Ion Chemical Ionization, NICI). Kỹ thuật NICI có độ nhạy đối với CAP cao hơn EI do trong phân tử cloramphenicol có chứa nguyên tử clo, mà NICI đặc biệt nhạy với các chất có chứa nguyên tố có độ âm điện cao. Khi phân tích bằng sắc ký khí, để tăng độ nhạy cho phép phân tích, cloramphenicol thường được dẫn xuất hóa thành trimetylsilyl-cloramphenicol (TMS-CAP). GC/MS, với kỹ thuật NICI, các mũi m/z đặc trƣng cho TMS-CAP là 466, 468, 470,376, 378. GC/MS/MS, với kỹ thuật NICI cho các mũi đặc trƣng 304, 322, 358, 394, 430. LOD có thể đạt đến 0,1ng/g mẫu [22,30].
1.3.2. Phương pháp quang [19,20,21,25]
Nguyên tắc chung của phương pháp quang này là khử nhóm nitro của cloramphenicol thành nhóm amino để tạo thành hợp chất có màu. Các nhóm nghiên cứu khác nhau có thể sử dụng các chất khác nhau để làm tác nhân khử.
Nhóm tác giả Devani MB. [20] khử nhóm nitro ở gốc hydrocacbon thơm bằng hỗn hợp Zn và Ca/HCl, cho sản phẩm tác dụng với trisodium pentacyanoaminoferrat đế tạo thành sản phẩm có màu đỏ tía có độ hấp thụ cực đại giữa 480 – 540 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính theo định luật Beer là từ 4 đến 32
àg/mL. Tỏc giả cũn ỏp dụng được phương phỏp này vào việc xỏc định hàm lượng cloramphenicol và các este của nó trong thuốc với hệ số thu hồi là 99,9% đối với cloramphenicol và khoảng 99,9% - 101,06% đối với các este. Phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi các thuốc khác thường được sử dụng như: benzocaine, lignocaine, sulfadiazine, nitrofurantoin, ascorbic acid, hydrocortisone, prednisolone, streptomycin, and tetracycline…
Hoặc cloramphenicol cũng có thể đƣợc khử bằng TiCl3, trong dung dịch axit axetic băng ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút nhƣ nhóm nghiên cứu của Chukwuenweniwe J Enoka [19] đã thực hiện. Sản phẩm khử đƣợc gia nhiệt với p- dimetylaminobenzaldehit trong 20 phút, sản phẩm tạo thành có màu vàng tươi, hấp thụ mạnh ánh sáng ở vùng khả kiến và tuân theo định luật Beer ở 440nm. Theo nhƣ tác giả biện luận, phương pháp là sự kế thừa phương pháp của Glazko và Wolf.
Theo phương pháp cũ, cloramphenicol được khử bằng kali bohydrat trong môi trường kiềm, tiếp đó là sử dụng Pd để tạo thành sản phẩm p- dimetylaminobenzaldehit. Tuy nhiên phương pháp này có 2 nhược điểm là chất tạo thành không tan được hoàn toàn trong môi trường kiềm và phản ứng không định lƣợng.
1.3.3. Phương pháp điện hóa [15,35,25,14,37]
1.3.3.1. Cực phổ xung vi phân [35]
Tác giả Van der Lee là người có nhiều nghiên cứu về cloramphenicol, đặc biệt là phát triển các phương pháp điện hóa [35] cũng như chế tạo các cảm biến điện hóa đối với cloramphenicol nhƣ đã đƣợc đề cập ở trên [38]. Trong số đó cơ bản nhất cloramphenicol được xác định bằng phương pháp cực phổ xung vi phân dựa trên sự khử nhóm nitro trên điện cực giọt thủy ngân [35]. Dung dịch nền là đệm axetat pH từ 4 đến 6, khoảng xuất hiện pic Ep = -0,23V (dao động từ -23mV đến 56mV) so với điện cực calomen và là -0,27V so với điện cƣc Ag/AgCl. Khoảng nồng độ có thể xác định là 300ppb đến 20ppm đối với máy Mode 174 và 100ppb
đến 20ppm đối với máy Mode 374. Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng cloramphenicol trong mẫu.
1.3.3.2. Cực phổ sóng vuông[15,37]
Các tác giả Alemu, Hailemichael; Hlalele, Lebohang [15] sử dụng điện cực cacbon thủy tinh (glasy cacbon) đã đƣợc tiền xử lý để tiến hành xác định cloramphenicol trong môi trường đệm CH3COONa/CH3COOH 0,05M pH 5,3.
Đường von-ampe vòng cho thấy pic khử của cloramphenicol xuất hiện ở thế - 0,646V. Khoảng tuyến tính làm việc tốt là 1.0 x 10-7 - 7.0 x 10-5 M cloramphenicol và giới hạn phát hiện là 6.0 x 10-9 M.
Sử dụng vi điện cực cacbon hoạt hóa, phương pháp này được dùng để xác định cloramphenicol ở hàm lượng thấp. Điều kiện tối ưu cho phương pháp là sử dụng dung dịch đệm 0,05mol/L HPO42- pH 7,8; Ep = - 0.646V. Khoảng tuyến tính 1.10-7 – 1.10-4 mol/L. Giới hạn phát hiện 4,7.10-8M [32].
1.3.3.3. Phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detecto điện hóa [34]
Phương pháp này là sự cải tiến của các phương pháp cực phổ thông thường trong cách tiến hành thí nghiệm. Thay vì dung dịch đo trong tế bào điện là cố định thì ở phương pháp này, dung dịch đo được thay đổi liên tục thông qua dòng chảy và thao tác bơm mẫu. Do đó, việc lặp lại thí nghiệm khá nhanh chóng và tín hiệu đo rất lặp lại ở các lần thí nghiệm khác nhau.
Nhóm tác giả người Nhật [34] sử dụng hệ điện cực trong đó điện cực làm việc là màng kim cương mỏng gắn nguyên tố Bo (boron-doped diamond thin-layer), điện cực so sánh Ag/AgCl và cực đối Pt. Nền đệm đƣợc chọn là đệm photphat pH 6 chứa 1% etanol. Thế làm việc E = -0,7V, khoảng tuyến tớnh thu là 0,1-50 àM (R2=0.9948), giới hạn phỏt hiện là 0,3àM.
1.3.3.4. Phương pháp điện di mao quản sử dụng đầu dò vi sợi cacbon [14]
Phương pháp này đòi hỏi thế áp vào rất cao, khoảng 20kV, trong mỗi lần đo cung cấp một xung 5kV trong thời gian 5s. Điều kiện tối ưu cho phương pháp này
là sử dụng dung dịch đệm 8,4.10-4mol/L HOAc – 3,2.10-4mol/L NaOAc. Trong phương pháp này, không cần đuổi oxi, điện tích điện cực càng nhỏ thì ảnh hưởng của oxi càng giảm. Khoảng tuyến tính 5.10-6 – 1.10-3mol/L, giới hạn phát hiện 9,1.10-7 mol/L.
1.3.4. Một số phương pháp khác [17,23,29,31]
Dư lượng Chloramphenicol trước đây thường được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunologically) hoặc sắc ký khí (gas chromatographically). Tuy nhiên, xét nghiệm miễn dịch men (enzyme immunoassay) lại cho thấy các ưu điểm rõ rệt so với các phương pháp truyền thống.
Không cần dùng đến các nguyên liệu phóng xạ, cũng nhƣ thời gian thực hiện xét nghiệm giảm đáng kể so với khi thực hiện phương pháp sắc ký khí.
Lâu nay muốn kiểm nghiệm sản phẩm một lô hàng thực phẩm thủy sản phải tiến hành lấy mẫu và biết đƣợc kết quả cũng phải mất cả tuần. Còn muốn nhanh bằng cách mua thiết bị phát hiện (đọc kết quả) thì lại không đủ điều kiện vì hệ thống máy và hóa chất rất đắt tiền, nhƣ máy sắc ký.
Đó là chưa nói đến việc vận hành mất nhiều thời gian, quy trình nhiều bước phức tạp cần phải có vài nhân viên đạt trình độ kỹ năng nhất định. Đặc biệt, do các thiết bị máy móc tinh vi nên việc xử lý mẫu thử rất phức tạp. Mặt khác, nhiệt độ phòng, độ ẩm không khí, độ chiếu sáng, hạn chế tối đa các chất trong không khí đều đặt ra rất khắt khe để tránh gây nhiễm môi trường xét nghiệm. Từ đó bắt buộc cần phải trang bị phòng vô trùng, tủ đặc biệt thiết kế để đựng dụng cụ xử lý rác và chất thải…
Hiện nay phương pháp phân tích miễn dịch cạnh tranh (ELISA ) là phương pháp tương đối đơn giản, chi phí không quá cao, kết quả xét nghiệm lại chính xác và có độ tương hợp cao với phương pháp sắc ký. Đây phương pháp xét nghiệm nhanh (GICA), dùng để định lƣợng Chloramphenicol trong mô thịt, cá, tôm… có thời gian xét nghiệm 20 phút, cho độ chính xác trên 95%.