Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Tách ADN tổng số
ADN tổng số từ 42 mẫu mô bệnh phẩm và 5 mẫu đối chứng được tách chiết theo quy trình hướng dẫn kèm theo trong bộ Kit tinh sạch ADN tổng số của hãng JMC R & D - Hàn Quốc.
2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lƣợng ADN tổng số a. Điện di trên gel agarose 0,8%
ADN tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
pha trong đệm TAE 1X và chạy ở hiệu điện thế 80V. Thang chuẩn ADN được sử dụng là λ/HindIII. Nếu trên bản gel điện di chỉ thấy xuất hiện 1 băng sáng duy nhất
có kích thước tương ứng với băng lớn nhất của marker chứng tỏ ADN tổng số đã được tách chiết thành công.
b. Đo mật độ quang phổ hấp thụ
Để xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số thu được, chúng tôi tiến hành đo mật độ quang phổ hấp thụ ở 2 điểm có bước sóng 260nm và 280nm.
Nếu tỷ số OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2 chứng tỏ ADN là sạch và đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu tiến hành phản ứng PCR. Các mẫu ADN tổng số đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch là các mẫu có giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2. Pha loãng các mẫu ADN với nước khử ion tới nồng độ 100 μg/ml và bảo quản cẩn thận trong tủ lạnh ở nhiệt độ - 200C để phục vụ cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
2.2.4. Nhân bản các exon nhờ phản ứng PCR 2.2.4.1. Thiết kế mồi
Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nhân bản các exon được thiết kế bởi công cụ “Primer blast” của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/). Các exon được nhân bản bao gồm toàn bộ exon và một phần trình tự intron chặn 2 đầu. Chi tiết các cặp mồi thiết kế được trình bày cụ thể trong Bảng 6.
Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm
Tên exon và kích thước (bp)
Trình tự mồi
(F: Forward – mồi xuôi; R: Reverse – mồi ngược)
Sản phẩm PCR (bp)
Exon 2 (155) F-5’TGAAGTCCAGCTAATACAGTGC-3’
R-5’GTGTCTCAAACCATTCTACTATCA-3’ 345 Exon 3 (279) F-5’CTTAGGCTTCTCCTGGCAATCTCTC-3’
281 R-5’TCTCAGTTTCCCCATGTCTCCAGCA-3’
Exon 6 (150) F-5’TGTTCCTCTGTTTTTCATGGCG-3’
R-5’TGGTATAATCATGTGGGTAACTGC-3’ 279 Exon 7 (200) F-5’GTTGAGACTTACGTGCTTAGTTGAT-3’
R-5’TGAGGACAGCACATTGCCAAG-3’ 351 Exon 8 (110) F-5’GTAACTTTGGAGACCTGCTGTACT-3’
R-5’CATCCACTGTCCACAAAGGTGCT-3’ 365 Exon 12 (246) F-5’GGGGGATTAAATGTATTTTTACGGC-3’
R-5’AACGTTACCCCCACAAAGCC-3’ 369 Exon 13 (205) F-5’ATATAATTTGTTTTGTAGGCCCCA-3’
244 R-5’GGGACTAGGAGATGCACTTACC-3’
Exon 14 (248) F-5’TGTAATTATGTGCTTCAGGTCTGC-3’
R-5’AGTTTCCCATTACCAAGTTCTGA-3’ 315 Exon 15 (176) F-5’TCTCATGCTGTCCCCTCACG-3’
235 R-5’TGAAAACAAACTGACAAACCTCTCT3’
2.2.4.2. Tiến hành phản ứng PCR
Thành phần cũng như chu trình nhiệt của một phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 7.
Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR Thông số các thành phần phản ứng PCR Chu trình nhiệt
Thành phần phản ứng PCR
Nồng độ ban đầu
Thể tích sử dụng (àl)
Giai đoạn Nhiệt độ (t0C)
Thời gian
ADN tổng số ~100ng/àl 4 Biến tớnh khởi động 94 5 phỳt Buffer (Mg2+) 10X 4 Biến tính khuôn 94 30 giây
dNTPs 2mM 4 Gắn mồi (*) 50 – 58 30 – 45 giây Mồi xuụi (F) 10àg/ml 1.5 Kộo dài chuỗi 72 30 giõy Mồi ngược(R) 10àg/ml 1.5 Ổn định 72 5 phỳt
Taq-ADN pol 1u 1.5 Bảo quản 4 ∞
H2O khử ion 33.5 Số chu kỳ 30
Tổng thể tớch 50àl (*): Thụng số cú thể thay đổi tựy exon
2.2.5. Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thƣ đại trực tràng SSCP là kỹ thuật phân tích đột biến dựa vào tính đa hình trong cấu trúc sợi đơn của phân tử ADN khi chúng có sự biến đổi so với trạng thái bình thường mà chúng thể hiện (Hình 9). Phương pháp này được mô tả lần đầu bởi Orita và cộng sự năm 1989 (xem thêm Mục 1.5.3 đã đề cập ở trên). Tuy nhiên, chúng tôi đã cải tiến một vài điều kiện thí nghiệm như dung dịch biến tính, thời gian và điện thế chạy cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm nhằm nâng cao độ tin cậy cho các kết quả
Mẫu ADN từ sản phẩm PCR của cỏc exon tương ứng, lấy ra khoảng 3 – 5àl và trộn với 16 – 18àl dung dịch biến tớnh LIS. Đõy thực chất là một loại đệm biến tính có nồng độ ion
thấp, chứa 10% sucrose.
Sau đó, hỗn hợp này được đem biến tính ở 950C trong khoảng 10 phút và đưa nhanh ra đá lạnh trong 5 phút với mục đích gây sốc nhiệt, tạo điều kiện thuận lợi cho sự biến tính giải phóng sợi đơn của phân tử ADN. Tiếp theo, mẫu đã biến tính được nạp lên các giếng đã được tạo sẵn trên bản gel polyacrylamide không biến tính 12% (PAGE
12%) trong hệ thống điện di và chạy trong khoảng thời gian từ 6 – 18h ở điện thế khoảng 6 – 10V/cm tùy vào kích thước mỗi exon cũng như điện thế dòng điện sử dụng. Tuy nhiên, trong đề tài này, mẫu đã biến tính được chạy điện di qua đêm ở điện thế 7V/cm và PAGE 12% pha với tỷ lệ các thành phần được thể hiện trong Bảng 8 dưới đây.
Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP
Thành phần Nồng độ
Acrylamide: Bis-Acrylamide (49:1) 12%
TAE 1X
Glycerol 5 – 10%
Nước Vừa đủ
Lưu ý:
Khi tiến hành kỹ thuật SSCP ở nhiệt độ phòng cần bổ sung glycerol 10% vào thành phần của gel. Nếu tiến hành trong môi trường nhiệt ổn định 40C thì không nhất thiết phải bổ sung glycerol.
Sau khi điện di, cẩn thận gỡ gel ra khỏi bản kính và tiến hành ngay bước nhuộm bạc. Sản phẩm điện di được sử dụng quy trình nhuộm bạc nhanh (khoảng 15 – 20 phút) của Z. W. An và cộng sự [10] với 3 bước cơ bản và thành phần 3 dung dịch nhuộm tương ứng được mô tả trong Bảng 9.
Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm Bước 1: Tiến hành
khoảng 5 đến 10 phút với dung dịch I
Bước 2: Tiến hành khoảng 3 đến 5 phút với dung dịch
II
Bước 3: Tiến hành khoảng 3 đến 5 phút
với dung dịch III Thành phần
dung dịch I
Thể tích sử dụng
(ml)
Thành phần dung dịch II
Thể tích sử dụng (ml)
Thành phần dung dịch III
Thể tích sử dụng
(ml)
Ethanol 95% 11 NaOH 6M 10.8 Ethanol 95% 11
HNO3 3.8 Na2CO3.10H2O 3.5 (g) HNO3 65% 3.08
AgNO3 0.2 (g) HCHO 30% 2.4 H2O Vừa đủ
H2O Vừa đủ H2O Vừa đủ
Ʃ VIII: 200ml Ʃ VI: 200ml Ʃ VII: 200ml
Lưu ý:
Sau bước nhuộm với dung dịch I, dùng nước cất để làm sạch phần dịch nhuộm vừa sử dụng trong 10 – 15 giây trước khi tiến hành bước nhuộm làm hiện băng điện di với dung dịch II. Cuối cùng, sử dụng dung dịch III để cố định các băng hiện trên bản gel và mang bản gel đi soi với máy soi gel dưới nguồn ánh sáng trắng, phân tích kết quả và chụp ảnh.