Protodioscin là một hợp chất saponin steroid đƣợc tìm thấy trong một số loài thực vật, chủ yếu ở các chi Tribulus họ bá vương (Zygophyllaceae), Trigonella họ đậu (Fabaceae) và Dioscorea họ củ nâu (Dioscereaceae) đặc biệt là cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [46]. Protodioscin có vị đắng, có màu vàng nâu tan trong nước, hơi tan trong methanol, nhƣng không tan trong dung môi chloroform.
Protodioscin có công thức hóa học theo IUPAC là C51H84O22 tên gọi là [26-O- β-D-Glycopyranosyl-22-hydroxyfurost-5-ene-3β, 26-diol-3-O-β-diglucorhamno- side] (Hình 1.8).
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của protodioscin [46].
1.2.2. Tác dụng dược lí của protodioscin.
16
1.2.2.1. Protodioscin tăng cường hoạt động tình dục và sinh sản
Protodioscin chiết xuất từ dịch chiết Bạch tật lê đã đƣợc chứng minh là có tác dụng kích thích tình dục ở một số loài động vật [22]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng protodioscin có đƣợc công dụng này là do khả năng làm tăng nồng độ thụ thể androgen trong tế bào, làm cho thụ quan trở nên nhạy cảm hơn với androgen nhƣ testosterone. Cơ chế tác động này chƣa đƣợc xác định rõ ràng, tuy nhiên, protodioscin đã đƣợc chứng minh là kích hoạt giải phóng oxit nitric trong mô thể hang của dương vật và làm tăng đáng kể về mức độ hormone testosterone, dihydrotestosterone và dehydroepiandrosterone của động vật [20].
Tăng cường hoạt động tình dục là tác dụng dược lí nổi bật của protodioscin.
Gauthaman và cộng sự (2003) đã nghiên cứu về tác động của dịch chiết Bạch tật lê (trong đó protodioscin chiếm 45% trọng lƣợng khô dịch chiết) lên hành vi tình dục chuột.
40 con chuột đƣợc chia thành 4 nhóm (I, II, III, IV) cho uống dịch chiết Bạch tật lê với nồng độ 2,5; 5,0 và 10 mg/kg thể trọng một lần mỗi ngày trong 8 tuần.
Theo dõi trọng lƣợng, huyết áp của các nhóm chuột thí nghiệm và ghi lại hành vi tình dục của chuột đực so với nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy: Tăng trọng lƣợng cơ thể (9, 23, và 18% đối với nhóm II, III và IV). Huyết áp (43% và 26% đối với nhóm III và IV) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Số lƣợng tham gia hành vi tình dục tăng (27% và 24%). Thời gian quan hệ tăng (19% và 22%) đối với nhóm III và IV có ý nghĩa thống kê. Giảm thời gian nghỉ giữa các lần quan hệ (16%, 23%, và 22% đối với nhóm II, III, và IV) và khoảng thời gian giữa các lần xuất tinh (20% đối với nhóm III) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Từ đó các tác giả kết luận: Protodioscin có tác dụng tăng trọng lƣợng cơ thể và cải thiện các thông số hành vi tình dục quan sát đƣợc ở chuột đồng thời chỉ ra sự gia tăng androgen và giải phóng của oxit nitric từ các dây thần kinh vào trong các thể hang [22]. Hoạt động tình dục của chuột được tăng cường bởi protodioscin được giải thích thông qua các các cơ chế sau:
17
1) Chuyển đổi trực tiếp thành phần hoạt chất protodioscin trong dịch chiết Bạch tật lê, cụ thể là, chuyển đổi protodioscin thành de-hydroepiandrosterone (DHEA) mà trung tâm là sự tác động thần kinh thông qua steroid bởi vì protodioscin là một hợp chất steroid có cấu trúc phù hợp với dẫn truyền các thông tin sinh học trong cơ thể.
(2) Tăng lƣợng DHEA dẫn tới tác động kìm hãm axit gamma aminobutyric (GABA) qua đó hỗ trợ tăng cường chức năng tình dục bởi vì GABA là chất ức chế tình dục đã đƣợc thử nghiệm trên các mô hình. Lƣợng GABA tăng lên sau khi xuất tinh, đánh dấu giai đoạn không hoạt động tình dục trên chuột.
3) Tăng mức testosterone và giảm dihydrotestosterone, hai tác động này ảnh hưởng lên hệ thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên để kích thích hành vi tình dục, bởi vì các hormon nam tính đƣợc chỉ ra là để cải thiện ham muốn tình dục và tăng vận chuyển nito oxide trong các thể hang của thỏ.
4) Điều hòa tổng hợp NO ở vùng trung gian vùng dưới đồi làm tăng dopamine (chất tạo cảm giác hƣng phấn), tăng kích thích và hoạt động tình dục thông qua việc dẫn truyền thần kinh ngoại biên [22].
Tác động của protodioscin lên chức năng tình dục nam giới đã đƣợc nghiên cứu từ trước đó, Arsyad (1996) đã đánh giá hiệu quả của protodioscin cho ham muốn tình dục, cương cứng, xuất tinh và cực khoái ở nam giới khi được sử dụng với nồng độ 3x2 viên nén 250 mg/ngày ở 15 nam giới độ tuổi từ 25-40 trong 60 ngày điều trị và 30 ngày sau điều trị.
Kết quả chỉ ra rằng điều trị bằng protodioscin với liều 3x2 viên 250 mg/ngày trong 60 ngày có thể làm tăng chất lƣợng và số lƣợng tinh trùng ở đàn ông, khôi phục và tăng cường ham muốn tình dục, cương cứng, xuất tinh và cực khoái của quan hệ tình dục, so với trước khi điều trị. Số lượng tinh trùng từ 9,89 triệu/mL tăng lên 15,73 triệu/mL, độ di động của tinh trùng tăng từ 24,33% lên 36% và hình thái tinh trùng bình thường tăng từ 35,93% lên 43,87% sau điều trị. Nồng độ hormon LH (IU/I) tăng từ 6,86 lên 9,90 sau 30 ngày điều trị và 7,10 sau 60 ngày điều trị.
18
Nồng độ testosteron (nmol/L) tăng từ 283,4 lên 328,4 sau 30 ngày điều trị và lên tới 379 sau 60 ngày điều trị.
Kết quả này là phù hợp với giả thuyết về tác dụng của protodioscin lên testosteron vì mức độ LH tăng lên do đƣợc điều trị bằng protodioscin đã kích hoạt các tế bào Leydig tăng bài tiết testosterone, do đó làm tăng mức testosterone trong máu. Nồng độ testosteron tăng lên làm gia tăng số lƣợng, tính di động và hình thái tinh trùng bởi vì testosteron có liên quan đến sự trưởng thành của tinh trùng trong mào tinh hoàn. Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy protodioscin làm tăng mức độ chuyển đổi testosterone thành dihydrotestosterone kích thích sự trưởng thành của tinh trùng đồng thời protodioscin cũng làm tăng sản xuất tinh trùng bằng việc kích thích các tế bào Sertoli và tế bào mầm [10].
Gauthaman và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tác động của dịch chiết Bạch tật lê lên các hormon giới tính của linh trưởng, thỏ và chuột để xác định công dụng của protosioscin trong điều trị rối loạn cương dương.
Dịch chiết Bạch tật lê đƣợc sử dụng với nồng độ 7,5; 15 và 30 mg/kg thể trọng ở linh trưởng cho nghiên cứu. Thỏ và chuột bình thường đã được điều trị với nồng độ 2,5; 5,0 và 10 mg/kg uống trong 8 tuần, để nghiên cứu mãn tính. Ngoài ra, Chuột bị thiến được điều trị bằng testosterone cypionate (10 mg/kg, tiêm dưới da, hai tuần một lần trong 8 tuần) hoặc uống dịch chiết Bạch tật lê (5,0 mg/kg/ngày trong 8 tuần). Mẫu máu đƣợc thu nhận cho phân tích testosterone (T), dihydrotestosterone (DHT) và dehydroepiandrosteronesulphate (DHEAS) bằng cách sử dụng phương pháp miễn dịch.
Kết quả cho thấy, ở động vật linh trưởng, nồng độ T tăng 52%, DHT tăng 31%
và DHEAS tăng 29% khi đƣợc điều trị với dịch chiết Bạch tật lê ở nồng độ 7,5 mg/kg. Ở thỏ, T và DHT đều tăng so với đối chứng, tuy nhiên, chỉ có DHT tăng 30% và 32% ở nồng độ điều trị 5,0 và 10 mg/kg có ý nghĩa thống kê. Ở chuột bị thiến, T tăng 51% và 25% đối với nồng độ dịch chiết điều trị tương ứng có ý nghĩa thống kê [20].
19
Từ đó có thể thấy, protodioscin trong dịch chiết Bạch tật lê có tác dụng làm tăng các hormon giới tính.
Gần đây hơn, Swaroop và cộng sự (2017) đã nghiên cứu tác động của dịch chiết hạt Trigonella foenum-graecum giàu protodioscin (20%) trên 50 tình nguyện viên nam (độ tuổi: 35-65) về mức độ tăng testosterone tự do và tổng số, chỉ số tinh trùng, sức khoẻ tim mạch, tinh thần, tâm trạng, độ ham muốn và sức khỏe tình dục trong thời gian 12 tuần. Các tình nguyện viên đƣợc sử dụng dịch chiết với nồng độ 500mg/ngày.
Kết quả cho thấy lƣợng testosterone tự do tăng 1,47 lần trong khi testosterone tổng số tăng 1,08 lần. Số lƣợng tinh trùng sau 4 tuần điều trị tăng từ 35,13 (triệu tinh trùng/mL) lên 48,9 (triệu tinh trùng/mL), sau 8 tuần điều trị là 86,16 (triệu tinh trùng/mL) và sau 12 tuần điều trị là 88,31 (triệu tinh trùng/mL). Tính di động của tinh trùng tăng từ 35,79% lên 45,73 sau 4 tuần điều trị 55,79 sau 8 tuần điều trị và 74,11% sau 12 tuần điều trị. Hình thái học những tinh trùng bất thường không có ý nghĩa thống kê trong 4 tuần điều trị tuy nhiên sau 8 tuần và 12 tuần điều trị đã có ý nghĩa thống kê về việc giảm hình thái bất thường của tinh trùng từ 42,46% giảm xuống còn 21,88% và 15,40% tương ứng. Kích thích tình dục tăng từ 4,02 lên 4,93 sau 4 tuần điều trị, lên đến 6,34 sau 8 tuần điều trị và lên tới 8,47 sau 12 tuần điều trị.
Kết quả này chỉ ra rằng protodioscin có tác dụng làm tăng testosteron và cải thiện hoạt động tình dục rõ rệt [48].
Cơ chế hoạt động của protodioscin đã đƣợc đề xuất nhƣ sau:
Để cải thiện khả năng sinh sản, protodioscin làm tăng mức sinh tinh trùng bằng cách kích thích tế bào Sertoli và tế bào mầm, dẫn đến tăng sản sinh tinh trùng.
Trong quá trình này, protodioscin tăng cường việc chuyển đổi testosterone thành dihydrotestosterone (DHT), do đó kích thích sự sản xuất protein Androgen Binding (ABP) trong tế bào Sertoli. Tăng sản xuất ABP dẫn tới sự hình thành phức hệ DHT- ABP (phức hệ kích thích sản xuất tinh trùng trong các tế bào mầm). Một phần khác
20
của phức hệ DHT-ABP đƣợc vận chuyển đến tuyến thƣợng thận làm tăng hiệu quả của sự trưởng thành của tinh trùng thành các tinh trùng có khả năng sinh sản.
Về sự cải thiện chức năng tình dục, protodioscin hoạt động bằng cách tăng chuyển đổi testosterone thành DHT (Hình 1.9). Ngoài việc tăng ham muốn tình dục, DHT cũng kích thích hồng cầu, sản xuất hồng cầu và phát triển cơ, góp phần cải thiện lưu thông máu cũng như hệ thống vận chuyển ôxy giúp làm tăng thời gian cương cứng dương vật và cải thiện xuất tinh sớm ở nam giới [11].
Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của protodioscin trong cải thiện chức năng tình dục [11].
1.2.2.2. Các tác dụng khác của protodioscin
Protodioscin cảm ứng apotosis ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư
Hibasami và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tác động của protodiocin trên 2 dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy HL-60 và dòng tế bào ung thƣ dạ dày KATO III.
Kết quả cho thấy tế bào HL-60 và tế bào KATO III bị ức chế khi nồng độ protodioscin tăng. Sự phát triển của tế bào HL-60 đã bị ức chế hoàn toàn khi sử dụng nồng độ 7,5 àM protodioscin. Mặt khỏc, protodioscin ức chế yếu sự phỏt triển của các tế bào KATO III. Sự ức chế tăng trưởng đáng kể của protodioscin đã gợi ý việc kích thích apoptosis. Về mặt hình thái học, sự phân mảnh của hệ gen DNA là đặc trƣng của apoptosis. Hình thái học của tế bào HL-60 cho thấy có apoptosis sau
21
3 ngày điều trị với 5,0 và 10àM protodioscin nhƣng khụng quan sỏt thấy apotosis ở dòng tế bào KATO III. Sử dụng phương pháp đếm dòng chảy tế bào cho thấy, HL- 60 đƣợc xử lớ với 2,5; 5,0 và 10àM protodioscin trong 3 ngày xuất hiện apoptosis 75,2; 96,3 và 100% tương ứng [26].
Trong một nghiên cứu khác, Oyama và cộng sự (2017) đã tách chiết protodioscin từ loài Dioscorea tokoro ở Đông bắc Nhật Bản và nghiên cứu sự ức chế của hợp chất này lên sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy Hl-60. Kết quả cho thấy protodioscin ức chế sinh trưởng của tế bào HL-60 với IC50 là 5,1àM [42].
Những kết quả này này chứng minh rằng protodioscin có thể kích hoạt hoạt động chống ung thƣ bằng cách kích hoạt apoptosis ở tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy người HL-60.
Protodioscin trong chữa trị bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường là một trong những vấn đề sức khoẻ được quan tâm trên toàn thế giới. Guo và cộng sự (2016) đã điều tra tiềm năng hạ đường huyết và hạ lipid máu của protodioscin trên chuột bị tiểu đường.
Sau 4 tuần cho ăn một chế độ nhiều chất béo, chuột đƣợc tiêm streptozotocin vào tĩnh mạch để gây bệnh tiểu đường. Chuột bị bệnh tiểu đường được chia thành 5 nhóm để nhận carboxymethyl cellulose sodium, metformin (200 mg/kg), và 3 nồng độ protodioscin (10, 20 và 40 mg/kg) liên tục trong 12 tuần. Nồng độ glucose máu, glycogen, cholesterol tổng số (TC), triglycerides (TG), axit béo không este hóa (NEFA) cholesterol giàu lipoprotein (HDL-c), cholesterol hàm lƣợng lipoprotein thấp (LDL-c), hemoglobin đƣợc glycosyl hóa (GHb), insulin và adiponectin đƣợc tính toán. Các kết quả cho thấy protodioscin làm tăng khả năng dung nạp glucose, làm giảm nồng độ glucose, GHb, TG, TC, LDL-c và NEFA trong khi đó tăng HDL- c, adiponectin và glycogen. Xét nghiệm mô học cho thấy protodioscin cải thiện rối loạn cấu trúc gan, làm giảm glucose máu và lipid máu ở chuột bị bệnh tiểu đường.
Do đó, protodioscin được xem như là một tiềm năng làm thuốc cho bệnh tiểu đường [25].
22
Protodioscin chống viêm và oxy hóa.
Protodioscin và methyl protodioscin có tác dụng chống viêm đã đƣợc báo cáo trong nhiều nghiên cứu trước đây. Liu và cộng sự (2017) đã điều tra các ảnh hưởng của protodioscin lên bệnh viêm khớp ở chuột.
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành các nhóm và đƣợc tiêm với các nồng độ protodioscin khác nhau (50, 100 và 200 mg/kg trọng lƣợng cơ thể). Nghiên cứu mô học, sự thay đổi các thông số sinh hóa và sự biểu hiện cytokine viêm để đánh giá hiệu quả chống viêm của protodioscin. Kết quả cho thấy, sau 15 ngày điều trị bằng 200mg protodioscin khối lƣợng của chân sau chuột đã giảm xuống trong khi trọng lƣợng cơ thể tăng lên so với nhóm đối chứng đồng thời giảm sƣng viêm mắt cá chân và giảm sự xâm nhiễm bạch cầu phụ thuộc vào liều lƣợng protodioscin sử dụng.
Ngoài ra khi sử dụng protodioscin ở nồng độ 200mg cho thấy sự hoạt động mạnh của các enzyme chống oxy hóa bao gồm: Catalase, Glutathione, Superoxide dismutase và giảm các cytokine tiền viêm. Do đó, protodioscin có tác dụng chống viêm, giảm xâm nhiễm bạch cầu và giảm các stress oxy hóa thông qua cơ chế cải thiện các enzym liên quan đến oxy hóa và các cytokine tiền viêm [35].
Protodioscin giảm lipid máu
Các rối loạn liên quan đến chuyển hoá, bao gồm chứng béo phì và tăng lipid máu là vấn đề quan trọng đối với sức khoẻ con người. Wang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tác động của protodioscin tách chiết từ thân và rễ của loài Dioscorea nipponica (Rhizoma Dio-scoreae Nipponicae) lên chứng tăng lipid máu.
Chuột bị chứng tăng lipid máu sau khi đƣợc điều trị với protodioscin cho thấy tăng thời gian đông máu đồng thời giảm nồng độ tryglyceride, cholesterol, lipoprotein trong máu và làm tăng tỷ lệ cholesterol giàu lipoprotein (HLD) / cholesteron chứa hàm lƣợng lipoprotein thấp (LDL). Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của protodioscin trong việc giảm lipid máu cũng nhƣ giảm cholesteron trong việc bảo vệ tim mạch [52].
23
1.2.2.3. Ứng dụng của protodioscin trong làm thuốc cải thiện sinh lí.
Protodioscin đã được chứng minh tác dụng dược lí nổi bật nhất là tăng cường chức năng tình dục. Do đó đƣợc ứng dụng trong việc sản xuất các loại thuốc tăng cường sinh lí nam giới. Trên thế giới đã có những loại thuốc sử dụng dịch chiết Bạch tật lê với thành phần chính là protodioscin nhƣ Libilov™ dạng viên nén 250mg hoặc nhƣ Tribulus M1445 của Mediherb dạng viên nén có chứa 100mg protodioscin hoặc 4x Sports Food Tribulus Terrestris chứa 95% Saponins, 80%
Protodioscin dạng viên 1000mg. Các loại thuốc này đều làm tăng cường phát triển cơ bắp, tăng hồng cầu, vận chuyển oxy trong máu, tăng hoocmon nam giới (LH, testosteron, FSH) do đó mà cải thiện chức năng tình dục.
1.3. Các phương pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 1.3.1. Các phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật
Có 4 phương pháp tiền tách chiết các hợp chất từ thực vật: Sấy khô bằng khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đông khô (Bảng 1.1) [13].
Bảng 1.1. So sánh các phương pháp tiền tách chiết [13]
Phương
pháp Sấy bằng khí Sấy bằng lò vi
sóng Sấy khô Sấy đông khô Cách sử
dụng
Sử dụng bức xạ điện từ
Sử dụng năng lƣợng
nhiệt
Dựa vào hiện tƣợng
thăng hoa Thời gian 3-7 ngày, vài tháng
cho đến một năm
Ngắn hơn sấy bằng khí
Ngắn hơn sấy bằng
khí
Qua đêm (12h)
Đặc điểm Không sử dụng nhiệt độ cao
Có hiện tƣợng làm nóng đồng
thời Ƣu điểm Các hợp chất chịu
nhiệt đƣợc bảo toàn. Hàm lƣợng
phenolic
24
cao hơn
Hạn chế
Thời gian tiến hành lâu
Mẫu có thể bị nhiễm bẩn ở điều kiện nhiệt độ không ổn định
Đôi khi gây ra sự giảm thiểu
lƣợng phytochemicals
Đôi khi không có ảnh hưởng
đáng kể đến hoạt động chống
oxi hoá
Mẫu bị mất do tỏa ra trong bình
đông.
Tốn kém
Có nhiều phương pháp tách chiết kể cả phương pháp truyền thống và hiện đại với mục đích là tách được hợp chất mong muốn. Các phương pháp tách chiết truyền thống bao gồm: Ngâm, truyền, thấm và sắc; Chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.2). Các phương pháp tách chiết hiện đại bao gồm: Chiết bằng lò vi sóng (MAE), chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE) (Bảng 1.3). ASE và SFE đƣợc sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả thấp. Mỗi phương pháp phù hợp với mẫu chiết và dung môi chiết khác nhau. Dung môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực, ví dụ nước, ethanol, methanol, n- hexane, ethyl acetate [13].
Bảng 1.2. So sánh các phương pháp tách chiết truyền thống [13]
Phương pháp
Đặc điểm Ƣu
điểm Nhƣợc điểm
Ngâm, truyền, thấm
và sắc
- Ngâm là phương pháp lấy bột thực vật ngâm với dung môi nhiệt độ phòng ít nhất 3 ngày để giải phóng các chất phytochemical hòa tan. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc lọc qua màng lọc, tùy thuộc vào loại chiết mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp.
- Truyền và sắc có quy trình tương tự nhƣ quá trình ngâm nhƣng thời gian nhanh hơn.
- Thẩm thấu có nguyên tắc tương tự 3 Dễ dàng và đơn giản
Bã của mẫu còn lại sau khi chiết vẫn chứa dung môi