2.1.1. Nguyên liệu
Cây Bạch tật lê (thân, quả, rễ) khô đƣợc lấy từ vùng trồng Bạch tật lê theo tiêu chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận. Cây đƣợc thu vào tháng 9, khi quả ngả sang màu hơi vàng.
Hình 2.1. Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khô và mẫu đã khô 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n- hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nước cất 1 lần.
- Dung môi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nước tinh khiết HPLC (Fisher)
- Bột sắc ký silica gel pha thường, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion HP20
- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít - Cột sắc ký thuỷ tinh
- Bình cầu thuỷ tinh cất quay.
- Bình định mức loại 25mL.
- Máy xay mẫu
- Máy cất quay chân không - Bể siêu âm
30
- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không.
- Phễu chiết phân lớp
- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada).
- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems.
- Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
- Máy siêu âm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê
Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nước. Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thường, đun hồi lưu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau. Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nước khô. Mẫu được chiết lần lượt 4 lần. Dịch chiết của các lần chiết được cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc. Ký hiệu là cao chiết A.
2.2.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Từ lượng Bạch tật lê tổng số ban đầu (2kg) được chiết bằng các phương pháp đun hồi lưu (~95ºC trong 2h), ngâm cách thuỷ 80ºC trong 2h, siêu âm (40ºC trong 0,5 giờ) và ngâm chiết (nhiệt độ thường trong 24h). Thu lấy cao chiết tiến hành cân khối lượng và so sánh hiệu suất của từng phương pháp.
Với phương pháp đã được lựa chọn, thời gian chiết và nhiệt độ chiết được tối ƣu bằng cách chiết trong các nhiệt độ (95ºC, 80oC và 60oC) và thời gian (2h, 3h và 4h). Cân và so sánh lượng cao chiết thu được để tìm ra điều kiện tối ưu cho phương pháp chiết.
2.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết tổng, cao chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để
31
loại bỏ các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Cao chiết A được hoà lại vào 3 lít nước sau đó chiết bằng dung môi ethyl acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nước được cô quay còn 2L để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.
2.2.4. Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
Lọc dịch B còn lại qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ dung môi nước, dung môi cồn 80%. Gom dịch rửa giải cồn 80% và cất loại dung môi thu đƣợc cao C.
Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thường, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lượng, cột nhồi 10cm) và dung môi rửa giải lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol 50:1, ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol 10:1 đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao D.
Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc đƣợc kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Điều kiện phân tích HPLC: Máy sắc ký Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. Cột sắc ký: Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent. Pha động gradient 2% acetonitrile trong nước trong 20 phút với tốc độ dòng: 0.5 ml/phút. Thể tích bơm mẫu 5μl, nhiệt độ cột 30ºC. Đầu dò DAD bước sóng phân tích 210 nm.
2.2.5. Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin
Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x).
Đường chuẩn định lượng thu được đạt độ tuyến tính cao với hệ số tương quan R2 ≥ 0,999 đối với phương pháp định lượng bằng DAD.
Chất chuẩn Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan Protodioscin Y = 0,998484x – 0,624106 0,99998
32
Hình 2.2. Đường chuẩn định lượng chất chuẩn protodioscin
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột 40 chuột nhắt trắng đực trưởng thành được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm:
nhóm I là nhóm chứng (10 chuột); nhóm II, III, nhóm IV là nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều lần lƣợt là 2,5mg/kg (10 chuột);
5,0mg/kg (10 chuột) và 10 mg/kg (10 chuột) cân nặng.
Điều trị bằng sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê cho chuột nhóm II, III, IV: cho sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê 1 lần/ngày với liều lƣợng lần lƣợt là 2,5 mg/kg; 5,0mg/kg và 10 mg/kg cân nặng trong 4 tuần.
Một ngày sau khi sử dụng liều cuối cùng thì chuột đƣợc lấy máu định lƣợng nồng độ các hormon testosterone, gonadotropin (FSH và LH). Xét nghiệm định lượng nồng độ hormon testosterone, gonadotropin (FSH, LH) bằng phương pháp elisa sử dụng qui trình xét nghiệm và máy xét nghiệm QTXN.MD.002/003/007 V 1,0 Cobas6000 tại bệnh viện phụ sản Trung ƣơng. So sánh nồng độ hormon sinh dục ở nhóm chứng và nhóm điều trị.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Microsoft excel và phần mềm STATA, kiểm định giá trị trung bình. Xác định hàm lƣợng và các tính chất lý hóa của sản phẩm, tiến hành lặp lại 3 lần.
33