Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95 chi và khoảng 1500 loài [18]. Hệ thống phân loại nấm men đƣợc xây dựng dựa trên các sự tương đồng và khác biệt giữa các taxa theo các đánh giá phân loại truyền thống với cơ sở là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại hiện đại với cơ sở là thông tin di truyền.
1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống
Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa để phân loại nấm men [1, 18].
Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào nhƣng rất đa dạng về hình thái tế bào. Thông thường tế bào nấm men có hình elip, hình cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đôi khi có hình quả chanh....Vì vậy, dựa vào sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các giống nấm men khác nhau.
Dựa vào đặc điểm nuôi cấy: Quan sát sự thay đổi của môi trường lỏng trong quá trình nuôi cấy để phân loại nhƣ: độ đục, độ tạo váng, bọt khí... Nếu nuôi trên môi trường thạch thì đánh giá bằng hình thái, kích thước, màu sắc (trắng, kem, đục,...) và bề mặt khuẩn lạc (nhẵn, xù xì, lồi, lõm,...)
Dựa vào đặc điểm sinh sản:
Sự nảy chồi: Quan sát số lƣợng chồi, vị trí nảy chồi, sự sắp xếp chồi trên tế bào mẹ, chồi có tách ra khỏi tế bào mẹ hay không nhằm phân biệt các chủng khác nhau.
Khả năng sinh bào tử: Sử dụng môi trường tạo bào tử, theo dõi thời gian sinh bào tử, hình dạng, số lƣợng bào tử trong nang, hình dạng nang, khả năng phá vỡ nang.
Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: sử dụng các kiểm tra về sinh lý sinh hóa như: khả năng lên men đường, khả năng đồng hóa đường và các hợp chất nitơ, khả năng tạo màng, khả năng tạo sắc tố, khả năng tiết một số enzym ngoại bào quan trọng (amylase, protease, lipase, kitinase, xenlulolase, cazeinase), khả năng tiết axit
amin, vitamin ra môi trường nuôi cấy [1, 18]. Xác định các đặc tính sinh lý, sinh hóa là một bước rất quan trọng để phân loại nấm men, là cơ sở sàng lọc các đặc tính công nghệ, theo đó người ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm cụ thể sau đây:
Lên men 13 loại đường như: D-glucose, D-galactose, sucrose, maltose, lactose, raffinose, inulin, starch, melibiose, cellobiose, D-xylose.
Đồng hóa 46 nguồn carbon bao gồm: glucose, galactose, L-sorbose, sucrose, maltose, cellobiose, trelalose, lactose, melibiose, raffinose, melezitose, inulin, tinh bột tan, D-xylose, L-arabinose, D- arabinose, D-ribose, L-rhamnose, D- glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat, inositol, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid.
Tính chống chịu với môi trường có nồng độ 0,01 % hoặc 0,1 % cycloheximide .
Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine.
Khả năng sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid.
Khả năng sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 42°C.
Khả năng tạo thành tinh bột trong môi trường nuôi cấy.
Sản sinh acid từ glucose.
Khả năng thủy phân Urê.
Khả năng phân giải Arbutin.
Khả năng phân giải lipid.
Khả năng sản sinh sắc tố.
Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucose.
Khả năng hóa lỏng gelatine
Phản ứng với Diazonium Blue B
Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%
Ngoài ra để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần đường trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch.
1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử
Ngoài phương pháp phân loại truyền thống các nhà phân loại còn có thêm một công cụ nữa là phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật di truyền và máy móc hiện đại giúp các nhà phân loại học có thêm cơ sở vững chắc để phân loại, thậm chí định tên đến loài một cách chính xác mà không cần nghiên cứu đến nhiều khía cạnh cùng một lúc.
Phân tích thành phần thành tế bào: Dựa trên cơ sở thành phần trong chuỗi polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào giữa các loài nấm men khác nhau thì khác nhau. Việc phân tích thành phần thành tế bào cung cấp một đặc điểm quan trọng để phân loại nấm men. Các thành phần của thành đƣợc sử dụng để phân tích bao gồm glucan, mannan, kitin, xylose [18].
Thành phần G/C: Tỉ lệ (G+C)/(A+T+G+C) có xu hướng không đổi đối với các loài nhất định, và khác nhau giữa các loài. Do vậy thành phần (G+C) phản ánh mối quan hệ phát sinh loài. Các chủng có thành phần (G+C) khác nhau 2- 2,5% thì thuộc hai loài khác nhau. Tuy nhiên thành phần (G+C) chỉ giúp phân biệt đƣợc hai loài khác nhau mà không xác định đƣợc hai chủng có cùng loài hay không vì nếu tỷ lệ (G+C) giống nhau nhƣng trình tự khác nhau thì chúng thuộc hai loài khác nhau [18, 19].
Loại CoQ: CoQ là chất mang quan trọng trong quá trình vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp. Các loài nấm men khác nhau có số lƣợng và loại CoQ khác nhau là cơ sở để phân loại nấm men đến mức độ chi. Các CoQ phát hiện ở nấm men: CoQ 6, CoQ 7, CoQ 8, CoQ 9, CoQ 10 và CoQ10 (H2) [18].
Kỹ thuật PCR fingerprinting: phương pháp fingerprinting là phương pháp dùng để phân nhóm dưới loài dựa trên sự tương đồng các đoạn DNA vệ tinh. DNA vệ tinh là các đoạn DNA có trình tự lặp lại lớn phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen của tế bào, thường không mã hóa cho gen và ít bị đột biến, thay đổi. Do đó chúng thường đƣợc dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại. Sử dụng các mồi đƣợc thiết kế theo trình tự của các DNA vệ tinh trong phản ứng PCR. Sau đó các đoạn DNA vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so sánh kích thước. Sự tương đồng của các phổ băng thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm men.
Trình tự rDNA: Do ribosome có ở tất cả các tế bào sinh vật và ít biến đổi nên nó là cơ sở nghiên cứu tổ tiên chung cho mọi sinh vật. Các rDNA có nhiều bản sao, dễ phân lập, kích thước nhỏ nên dễ dàng phân tích các đặc điểm liên quan bằng các kĩ thuật hiện đại nhƣ: RFLP, AFLP, hoặc đọc trình tự nucleotit, từ đó phân loại các vi sinh vật một cách chính xác hơn. Các đoạn rDNA thường được chọn là: rDNA 5S, rDNA 5.8S, rDNA 18S, rDNA 26S, và ITS.
Đoạn gen mã hóa rDNA 5S: trước đây được sử dụng nhiều trong phân loại do nó có kích thước nhỏ (120 Nu) dễ xác định trình tự và có tính bảo thủ cao, là cơ sở để xác định mối quan hệ phát sinh loài trên phổ rộng. Hiện nay vai trò rDNA 5S đƣợc thay thế bởi rDNA 18S, rDNA 26S do chúng cung cấp nhiều thông tin hơn.
Đoạn gen mã hóa rDNA 18S: Đoạn gen này có kích thước lớn, có chứa các vùng bảo thủ ở các phần khác nhau. Do vậy phân tích trình tự rDNA 18S cho phép xác định mối quan hệ sinh vật từ ngành cho đến loài, hiệu quả hơn khi kết hợp với đặc điểm (G+C), CoQ, thành tế bào để phân loại. Tuy nhiên việc phân tích trình tự rDNA 18S có nhiều hạn chế do kích thước của chúng quá lớn gây tốn kém trong
đọc trình tự, làm cản trở việc áp dụng kỹ thuật này một cách rộng rãi trong phân loại.
Đoạn gen mã hóa rDNA 26S: Một trong những thành tựu quan trọng đã đạt đƣợc trong nghiên cứu đa dạng nấm men gần đây là thiết lập đƣợc cơ sở dữ liệu về trình tự D1/D2 của rDNA 26S cho tất cả các nấm men đã biết. Điều đó cho phép so sánh loài mới phân lập với các loài đã biết, nhờ đó xác định đƣợc tên và vị rí của nó trong hệ thống phân loại một cách nhanh chóng và dễ dàng. Đoạn D1/D2 của rDNA 26S được chọn để nghiên cứu vì kích thước nhỏ (600 bp), và khác nhau giữa các loài (tính đặc hiệu loài cao), các chủng khác nhau dưới 1% nucleotit thì cùng một loài và trên 1% có thể thuộc các loài khác nhau. Tuy nhiên cần phải sử dụng nhiều gen để phân tích thì hiệu quả phân loại sẽ cao và chính xác hơn.
Vùng ITS: Vùng này nằm giữa rDNA 18S và rDNA 26S, có kích thước khoảng 500 bp. Do có tính bảo thủ cao, kích thước nhỏ nên vùng ITS được sử dụng trong phân loại khá phổ biến như đoạn D1/D2 của rDNA 26S. So với mức độ tương đồng của đoạn D1/D2 thì vùng ITS cũng tương tự, các chủng khác nhau dưới 1%
nucleotit thì đƣợc coi là cùng loài và trên 1% thì có thể chúng thuộc các loài khác nhau [14, 16].