P HÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.3. P HÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING

Do sự đa dạng và sự sai khác không rõ ràng giữa các chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng nhƣ tế bào làm cho việc phân loại dựa vào những đặc điểm này gặp nhiều khó khăn đó cũng chính là đặc trƣng của chi này làm cho sự phân loại chúng đến nay vẫn gây tranh cãi, phân nhóm bằng hình thái là một bước để giảm bớt sự

khó khăn khi phân nhóm bằng các phương pháp tiếp theo. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập đƣợc một cách chính xác, chúng tôi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 126 chủng phân lập đƣợc sử dụng mồi MST2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’). 126 chủng được nuôi cấy trên môi trường Malt-Glucose 2°Bx sau 3 ngày thu nhận để tách tế bào như mô tả trong phần phương pháp, sau đó tiến hành tinh chế DNA. DNA sau khi tinh chế đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR với chu kỳ gia nhiệt như đã nêu trong phần phương pháp. Sản phẩm được điện di trên agarose 1 % trong TAE với hiệu điện thế 50V. Kết quả trình bày trong hình 11. Kết quả phân nhóm bằng fingerprinting đƣợc đối chiếu lại với kết quả phân nhóm bằng hình thái.

Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc, M – GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Thermo sciencetific)

Bảng 4. Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting

STT Chủng Ký

hiệu STT Chủng Ký

hiệu STT Chủng Ký hiệu 1 TBY 509.3 B79 33 TBY 1521.1 B111 65 TBY 2060.1 B148 97 TBY2046.1 B181 2 TBY 505.2 B80 34 TBY 1521.2 B112 66 TBY 1885 B149 98 TBY 2085.4 B182 3 TBY518.3 B81 35 TBY 1605.2 B113 67 TBY 2041.1 B150 99 TBY 1932 B183 4 TBY 511.3 B82 36 TBY 1152 B114 68 TBY 2041.8 B151 100 TBY1932 B183 5 TBY 511.2 B83 37 TBY 1378.1 B115 69 TBY2108.3 B153 101 TBY 2129.2 B184 6 TBY 503.3 B84 38 TBY 1418.1 B116 70 TBY 2054.2 B154 102 TBY 2041.4 B185 7 TBY 635.2 B85 39 TBY 1418.4 B117 71 TBY 2054.1 B155 103 TBY 2108.10 B186 8 TBY 636.1 B86 40 TBY 1599.1 B118 72 TBY 1922.5 B156 104 TBY 2108.7 B187 9 TBY 621.2 B87 41 TBY 1235.2 B119 73 TBY 1944.3 B157 105 TBY 1944.11 B188 10 TBY 540.2 B88 42 TBY 1418.6 B120 74 TBY 1944.5 B158 106 TBY 2108.8 B189 11 TBY 629.1 B89 43 TBY 1468 B122 75 TBY 2085.7 B159 107 TBY 2108.6 B190 12 TBY 615 B90 44 TBY 1897.1 B126 76 TBY 1944.7 B160 108 TBY 2042.1 B191 13 TBY 614.1 B91 45 TBY 1897.2 B127 77 TBY 1944.1 B161 109 TBY 2056.2 B192 14 TBY 607.2 B92 46 TBY 1897.4 B128 78 TBY 2041.5 B162 110 TBY 2085.8 B193 15 TBY 628 B93 47 TBY 2038.1 B129 79 TBY 2045.1 B163 111 TBY 2045.5 B194 16 TBY 606.1 B94 48 TBY 2038.2 B130 80 TBY2108.5 B164 112 TBY 2041.3 B195 17 TBY 507.2 B95 49 TBY 2038.3 B131 81 TBY2045.2 B165 113 TBY 2044.3 B196 18 TBY 503.2 B96 50 TBY 2038.5 B132 82 TBY2044.6 B166 114 TBY2044.2 B197 19 TBY 507.3 B97 51 TBY 2085.1 B133 83 TBY 2041.6 B167 115 TBY 2041.10 B198 20 TBY 621.1 B98 52 TBY 2085.2 B134 84 TBY 2045.4 B168 116 TBY 2045.6 B199 21 TBY 612.2 B99 53 TBY 2085.3 B135 85 TBY 2127.3 B169 117 TBY 2029.4 B200 22 TBY 1065.1 B100 54 TBY 2085.5 B137 86 TBY 2041.2 B170 118 TBY 2118.1 B201 23 TBY 1065.2 B101 55 TBY 2085.6 B138 87 TBY 2041.7 B171 119 TBY 2056.1 B202 24 TBY 1065.3 B102 56 TBY 1944.6 B139 88 TBY 2129.4 B172 120 TBY 2092.3 B203 25 TBY 1320.1 B103 57 TBY 1944.9 B140 89 TBY 2038.4 B173 121 TBY 2091.2 B205 26 TBY 1320.2 B104 58 TBY 1944.10 B141 90 TBY 1922.6 B174 122 TBY 2125.1 B206 27 TBY 1316.1 B105 59 TBY 1944.2 B142 91 TBY 2127.4 B175 123 TBY 1922.11 B207 28 TBY 1235.1 B106 60 TBY 1944.4 B143 92 TBY 2092.1 B176 124 TBY 1923.1 B208

STT Chủng Ký

hiệu STT Chủng Ký

hiệu STT Chủng Ký hiệu 29 TBY 1316.2 B107 61 TBY 2044.1 B144 93 TBY 2118.4 B177 125 TBY 1923.2 B209 30 TBY 1448.2 B108 62 TBY 2044.4 B145 94 TBY2045.7 B178 126 TBY 1923.3 B210 31 TBY 1488.2 B109 63 TBY 2044.6 B146 95 TBY 2118.3 B179

32 TBY 1378.5 B110 64 TBY 1922.4 B147 96 TBY 1944.8 B180

Từ kết quả thể hiện ở hình 11 cho ta thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm men có các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lƣợng bản sao cũng nhƣ vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên DNA vệ tinh cho độ phân giải đến dưới loài.

Các chủng có cùng một phổ băng chắc chắn sẽ thuộc cùng một loài, các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc các loài khác nhau tùy theo mức độ khác biệt.

Các chủng có cùng phổ băng sẽ đƣợc xếp vào cùng một nhóm, những chủng có phổ băng khác nhau ít hay băng điện di mờ sẽ đƣợc xếp thành các nhóm khác nhau để tránh bỏ sót. Theo cách đó chúng tôi đã chia 126 chủng nấm men thành 25 nhóm (bảng 5).

Bảng 5. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting

Nhóm Chủng Chủng đọc

trình tự

Chủng đọc trình tự 1 B89, B90, B91, B92,B93,B94, B98,

B113, B115, B118 B90 TBY 615

2 B87 B87 TBY 621.2

3 B95, B96, B108, B109, B110 B95 TBY 507.2

4 B79, B80, B81, B82, B83, B84 B83 TBY 511.2

5 B123 B123 TBY 1529

6 B106, B119 B119 TBY 1235.2

7 B99 B99 TBY 612.2

8 B85, B86, B88 B85 TBY 635.2

9 B116, B117, B120, B122 B116 TBY 1418.1

10 B100, B101, B102 B100 TBY 1065.1

11 B97, B111, B112 B112 TBY 1521.2

12 B121 B121 TBY 1520.3

13 B114 B114 TBY 1152

14 B103, B104, B105, B107 B103 TBY 1320.1

15 B126, B127, B128 B126 TBY1897.1

B129, B130,B131, B132, B133 B134, B135, B136, B137, B138 B139, B140, B141, B142, B143 B147, B173, B174, B177, B180

B131, B177 TBY2038.3, TBY2118.4

Thực tế nghiên cứu trước đây cho thấy, những chủng có hình thái khuẩn lạc giống nhau khi phân nhóm bằng fingerpringting sẽ cho phổ băng giống nhau, khi phân tích trình tự cho kết quả cùng loài, những chủng hình thái giống nhau nhƣng lại cho phổ băng sai khác đôi chút thì khi phân tích trình tự thì vẫn cùng 1 loài, điều này có thể giải thích từ rất nhiều nguyên nhân nhƣ quá trình tách DNA, quá trình PCR, hay bản thân giữa các chủng vi sinh vật trong cùng 1 loài cũng có sự sai khác rất nhỏ về mặt di truyền. Chính vì sự đa hình thái khuẩn lạc, tế bào, đa dạng trong di truyền này mà khi phân loại Moniliella cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.

3.4. Phân loại một số chủng nấm men dựa vào phân tích trình tự rDNA

Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra 39 chủng đại diện của 25 nhóm (bảng 5) để phân tích trình tự. Chúng tôi chọn đoạn D1/D2 của rDNA 26S và vùng ITS của rDNA để phân tích. Do kích thước của các đoạn này khá ngắn (khoảng 600 bp), tính bảo thủ rất cao giữa các loài, mức độ sai khác về trình tự dưới 1% thì chúng cùng một loài, trên 1% thì thuộc các loài khác nhau.

Đồng thời, trình tự của các đoạn này của các loài đã biết đã đƣợc công bố trên GenBank, nên dễ dàng cho việc so sánh trình tự với các loài mới phân lập đƣợc.

Nhƣ vậy với các ƣu điểm này, đoạn D1/D2 và vùng ITS rất thích hợp cho việc phân tích trình tự để định tên nấm men.

17 B144, B145, B146, B148, B169, B172, B192

B144, B169, B172, B192

TBY 2044.1, TBY 2127.3, TBY 2129.4, TBY 2056.2

18 B149, B157 B149 TBY 1885

B150, B151, B153, B168, B171, B178, B181, B183, B187, B191, B186 B163, B164, B165, B166, B168, B178 B181, B183, B188, B189, B190, B193 B196, B197, B198, B199

B150, B151, B171, B183, B187, B191,

B186

TBY 2041.1, TBY 2041.8, TBY 2041.7, TBY 1932, TBY 2108.7, TBY2108.10, TBY2042.1

20 B159 B159 TBY 2085.7

21 B167, B194, B195 B167 TBY 2041.6

22 B170, B155, B156, B162, B184, B158,

B155, B162, B170, B158,

B184

TBY 2054.1, TBY 2041.5, TBY 1944.5, TBY 2041.2,TBY 2129.2 23 B175, B200, B202, B203, B204

B205, B206, B208, B209, B210 B175 TBY2127.4

24 B176, B182 B176 TBY2092.1

25 B179, B185, B201, B207 B179 TBY 2118.3

Chúng tôi đã tách DNA tổng số của 39 chủng nấm men sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn DNA (kích thước khoảng 1200bp) chứa vùng ITS và đoạn D1/D2 bằng cặp mồi ITS1 và NL4. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh chế và đọc trình tự với 4 mồi là ITS1, ITS4, NL1, NL4. Kết quả đọc trình tự sau đó đƣợc xử lý và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm BioEdit, MEGA 5.3. Kết quả thể hiện trên hình 12.

Dựa vào phân tích hình thái và trình tự, 126 chủng nấm men đen Moniliella khác nhau đã phân lập đƣợc chia thành các nhóm, trong đó 20chủng M. megachileiensis, 20 chủng M. nigrescens, 2 chủng M. mellis, 6 chủng loài mới gần với M. suaveolens trên (tên dự kiến M. carnis), 26 chủng loài mới gần M. spathulata (tên dự kiến M.

dehoogii), 5 chủng M. spathulata, 15 chủng M. suaveolens, 3 chủng là loài mới gần nhất với M. spathulata nhƣng khác 6 chủng trên (tên dự kiến M. sojae), 3 chủng là loài mới gần nhất với M. pollinis (Moniliella sp3.), 26 chủng là loài mới gần với M.

fonsecae., 4 chủng chƣa phân loại đƣợc (phụ lục 3).

Như vậy kết hợp với 78 chủng nấm men đen Moniliella đã phân lập được trước đó, hiện nay trong bộ sưu tập đã có 204 chủng nấm men trong đó 20 chủng gần với M. mellis, 10 chủng M. acetoabutans, 25 chủng M. megachiliensis, 5 chủng M.

spathulata, 16 chủng M. suaveolens, 2 chủng M. mellis, 70 chủng là loài mới gần với M. spathulata (trong đó 55 chủng phân lập đƣợc từ thớt, 15 chủng phân lập đƣợc từ hoa) tên dự kiến M. dehoogii, 26 chủng là loài mới gần với M. fonsecae (tên dự kiến M. byzovii), 5 chủng là loài mới gần nhất với M. suaveolens (tên dự kiến M.

nemchuae), 4 chủng là loài mới gần nhất với M. megachiliensis (tên dự kiến M.

bakeri), 10 chủng là loài mới gần nhất với. M. suaveolens nhƣng lại khác biệt với 5 chủng là loài mới gần với M. suaveolens ở trên (tên dự kiến M. carnis), 3 chủng là loài mới gần nhất với M. dehoogii (tên dự kiến M. sojae), 4 chủng là loài mới gần nhất với M. pollinis (Moniliella sp3.) và 3 chủng là loài mới khác TBY 38.6, TBY 195.5 (Moniliella sp1.), TBY 342 (Moniliella sp2.).

Hình 12. Vị trí các chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella. Mã số GenBank của trình tự rDNA sau tên loài (thanh chèn tương ứng 2% khác biệt trình tự)

Moniliella dehoogii

Moniliella dehoogii TBY 348 Moniliella dehoogii TBY 2118.4

Moniliella s p1. TBY 195.5

Moniliella sp1. TBY 38.6

Moniliella spathulata CBS 241.79T (AF335526)

Moniliella spathulata TBY 1320.1 Moniliella sojea sp. nov. SS4.2 Moniliella sojae sp. nov. TBY 1065.1

Moniliella

carnis

TBY

385.2

Moniliella

carnis

TBY

1418.1

Moniliella

carnis

KFP

246 T

(JQ814873) Moniliella

suaveolens CBS 542.78T

(AF335524) Moniliella

suaveolens

TBY

615

Moniliella nemchuae sp. nov. BY2

Moniliella nemchuae sp.

nov

TBY

368.2

Moniliella nemchuae

sp.

nov.

TBY 367

Moniliella

sp.

UWOP S

95 .766.4

(AF313370)

Moniliella barkeri

sp.

nov.

TBY

372

Moniliella barkeri

sp.

nov.

TD9

Moniliella

sp3.

TBY

30.1

Moniliella

sp3.

TBY

1897.1

Moniliella

oedocephalis CBS 649.66 T

(AF335521)

Moniliella madida

CBS

240.79 T

(AF335522)

Moniliella

p ollinis CBS 461.67 T

(AF335525)

Moniliella

megachiliensis

CBS 190.92 T

(EF137916)

Moniliella

megachiliensis

TBY

2056.1

Moniliella sp2.

TBY

342

clone *1

Moniliella sp2. TBY 342 clone

Moniliella

acetoabutens CBS 169.66 T

(EU252153)

Moniliella acetoabutans TBY

Moniliella

sp.

nov. TBY

2092.1 Moniliella mellis CBS

350.33 T

(EU545185) Moniliella mellis TBY

1885

Monil iella nigrescens

CBS

269.81 T

(EF137917)

Moniliella

sp.

UWO . 01 . 642 .2

Monil iella

fonsecae

CBS 10551 T

(DQ400366)

Moniliella sp. UWO. 95 .403 . 3 Moniliella byzovii TBY 2041.7 T

(KC213817) Moniliella

byzovii TBY 1932 Moniliella

byzovii TBY

2108.7

Phylloporia

pectinata R. Coveny 113

(AF411823)

1 00

100

0.02