Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.3. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, phân loại của các chủng vi khuẩn

Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn có hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio

24

harveyi [4].

+ Cách tiến hành:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa lam kính, hong khô.

- Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần.

- Nhuộm bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

- Nhỏ Lugol trong 1 phút.

- Rửa bằng cồn tẩy trong 30 giây - Lau lam kính, hong khô

- Nhuộm bổ sung bằng Safranin trong 1 phút.

- Rửa nước, để khô trong không khí.

- Nhỏ dầu, soi kính (dùng vật kính 100x)

- Kết quả: Gram dương: bắt màu tím. Gram âm: bắt màu hồng.

2.3.3.2. Phương pháp xác định khả năng lên men yếm khí của các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing của Vibrio harveyi

+ Môi trường chọn lọc: Peptone (2g), NaCl (5g), KH2PO4 (0,3g), Agar (3g), Bromthymol blue (1%) (3ml), H2O (1l), pH (7.1).

+ Phương pháp tiến hành: Đổ 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp khử trùng 121C trong 20 phút, thêm 0,5 ml Glucose 10% vào mỗi ống nghiệm, cấy mỗi chủng vi sinh vật vào 2 ống, bổ sung 1 lớp dày paraffin (đã hấp khử trùng) để tạo điều kiện kị khí sau đó để ở điều kiện nhiệt độ 28oC. Nếu có sự chuyển màu từ xanh sang đỏ ở cả 2 ống nghiệm thì đó là vi khuẩn lên men yếm khí.[20]

2.3.3.3. Phương pháp thử nghiệm tính di động

+ Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của vi sinh vật

+ Môi trường: LB 3% NaCl 0,2% agar: peptone (10g); cao nấm men (5g);

NaCl (30g); agar (2g). pH ~ 8 Khử trùng 121C trong 20 phút.

Đổ MT ra đĩa petri

+ Tiến hành: Vi khuẩn sau khi hoạt hoá được cấy bằng tăm vô trùng chấm nhẹ vào đĩa petri đựng môi trường LB 3% NaCl 0,2% agar. Cất đĩa petri đã cấy vi

25

khuẩn trong tủ 30C.

2.3.3.4. Phương pháp thử nghiệm MR (methyl red)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm axít bền.

VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm. VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính axít tạo thành lại chuyển hoá tạo thành các sản phẩm trung tính).

+ Môi trường MR – VP: Glucose (5g); peptone (5g); Na2HPO4 (5g). H2O (1l). pH ~ 6,9.

Chia 3ml mỗi ống nghiệm. Tiệt trùng 121C/20 phút.

+ Tiến hành: Vi khuẩn có hoạt tính ức chế sự phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing được cấy trên môi trường MR – VP. Ủ 37C từ 1 – 5 ngày.

Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+): có màu đỏ, âm tính có màu vàng [20].

2.3.3.5. Phương pháp thử nghiệm VP (Voges–Proskauer)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hoá 2,3 butanediol thành acetoin khi có oxy và chuyển hoá tiếp acetoin thành diacetyl.

Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo thành phức diacetyl-guanidin có màu đỏ.

+ Môi trường MR – VP: Glucose (5g); peptone (5g); Na2HPO4 (5g); H2O (1000ml). pH ~ 6,9.

Chia 3ml mỗi ống nghiệm. Tiệt trùng 121C/20 phút.

+ Tiến hành: Thuốc thử: Dung dịch A : α-napthol 5%.

Dung dịch B: KOH 40%.

- Cấy VSV trong môi trường MR-VP. Ủ trong 24h – 48h, 37C.

- Bổ sung thuốc thử vào MT (0,6ml A và 0,2ml B), lắc nhẹ.

- Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất 4h

- Dương tính: Dịch thể chuyển sang màu đỏ. Âm tính: Không đổi màu.[20]

2.3.3.6. Thử nghiệm ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase)

+ Nguyên tắc: Phát hiện các VSV có hệ enzyme fl-galactosidase – enzyme cảm ứng. O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) có cấu trúc tương tự như

26

lactose. Trong quá trình thủy phân, nhờ tác động của các enzyme β-galactosidase, ONPG phân cắt thành hai dư lượng, galactose và o-nitrophenol. ONPG là hợp chất không màu: O-nitrophenol có màu vàng.

+ Môi trường KIA: peptone (20g); lactose (20g); glucose (1g); NaCl (5g);

Feric ammonium citrate (0,5g); sodium thiosulphate (0,5g); agar (15g); đỏ phenol (0,025g); nước cất (1l). pH ~ 7,4 ± 0,2.

+ Môi trường ONPG: casein peptone (7,5g); NaCl (3,75g); Na2HPO4 (0,35g);

ONPG (1,5g); H2O (1l). pH ~ 7,5 ±0,2.

+ Tiến hành:

- VK được cấy trên môi trường KIA (TSI) ở 37C qua đêm. Sau đó, hoà tan VK trong 0,05ml nước muối sinh lý tạo thành dịch huyền phù.

- Thêm 1 giọt toluene, lắc mạnh để giải phóng enzyme - Thêm ONPG

- Đặt hỗn hợp trong tủ ấm 37C.

- Đọc kết quả: Dương tính: Dịch thể chuyển sang màu vàng. Âm tính: màu không đổi [20].

2.3.4. Phân tích gen 16S rRNA của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tuyển chọn được chủng VSV có triển vọng đối kháng cao, tiến hành tách DNA tổng số, gen 16S rRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi p63F (5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC3′,mồi xuôi) và

p1378R (5’CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG3’,mồi ngược) [24] được cung cấp bởi Integrated ADN Technologies - IDT (Singapore).Độ đặc hiệu và hiệu quả của cặp mồi này đã được nghiên cứu và thử nghiệm với nhiều loài vi khuẩn và mẫu môi trường, cho thấy cặp mồi này rất hữu ích cho khuếch đại gen 16S rADN trong nghiên cứu về sinh thái vi sinh vật.

2.3.4.1. Phương pháp tách DNA tổng số

+ Nuôi cấy vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế phát quang liên quan tới quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio được nuôi cấy trên môi trường LB 3% NaCl.

+ DNA của các chủng vi khuẩn được tách chiết theo protocol sau:

27

- Hút 1 ml nước MQ đã khử trùng vào ống eppendorf.

- Dùng tăm bông vô trùng (hoặc que cấy) lấy khuẩn lạc đã nuôi cấy trên đĩa môi trường, hòa tan tế bào vào ống eppendoft đã chuẩn bị, trộn đều bằng vortex rồi đem ly tâm ở 8000 vòng/ph trong 10 phút (rửa mẫu).

- Hút bỏ phõ̀n dịch  cho 300àl nước MQ vụ trựng vào mẫu, trộn đờ̀u cho phần cặn hòa tan lại.

- Bụ̉ sung 300 àl hỗn hợp Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) mix kỹ bằng vortex hoặc dùng tay trong khoảng 30 giây.

- Ly tâm ở 14000v/p, nhiệt độ phòng, trong 12 - 15 phút.

- Dùng pipet nhẹ nhàng hút pha dịch nổi trên cùng và chuyển sang 1 ống eppendorf khác (200 àl).

- Bụ̉ sung theo thứ tự: 1 àl Glycogen; 100àl ammonium acetate 7,5M; và 750 àl Ethanol 100%.

- Ủ trong ngăn đá (- 20oC) qua đêm

- Ly tâm ở 14000v/p, 4C trong 30 - 40 phút để tủa DNA.

- Gạn bỏ phõ̀n dịch, bụ̉ sung 150 àl ethanol 70%, mix nhẹ bằng pipet.

- Ly tâm ở 14000v/p, 4oC trong 10 phút để rửa DNA. Lặp lại bước này 2 lần.

- Nhẹ nhàng gạn bỏ phần dịch, để khô.

- Bụ̉ sung 20 – 100 àl nước PCR vào đờ̉ hũa tan DNA (tựy vào mỗi mẫu).

- Dịch DNA được giữ ở -200C

- Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA 2.3.4.2. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR 9700, với điều kiện phản ứng:

khởi đầu biến tính ở 95oC trong 5 phút; tiếp theo là 30 chu trình PCR (biến tính ở 94oC trong 45 giây, gắn mồi ở 50oC trong 45 giây và tổng hợp sợi ở 72oC trong 1 phút). Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.

- Thành phần phản ứng PCR:

Water nuclease free 8,5àl

Master Mix 2X 12,5àl

Primer p63F 1,5àl

28

Primer p1378R 1,5àl

DNA template: 1àl. Đối chứng õm (-) thờm 1àl water nuclease free.

Tụ̉ng thờ̉ tớch: 25àl/ống.

- Chu trình nhiệt:

95C 5 phút

94C 45s

53C 45s 30 cycles 72C 60s

72C 5 phút

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 %. Gel được chạy trên thiết bị điện di với đệm TAE ở điện thế 100V trong 20 phút. Bản gel được kiểm tra bằng máy soi gel.

2.3.4.3. Phương pháp điện di, soi gel

Sản phẩm PCR cần kiểm tra được nhuộm và điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, điện trường với hiệu điện thế 100V/20 phút.

Tiếp đó, tiến hành soi gel chụp ảnh sản phẩm điện di bằng máy soi UV.

2.3.4.4. Phương pháp tinh sạch DNA

Kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-nagel, Đức) được sử dụng để tinh sạch DNA. Các bước bao gồm:

- Chuẩn bị các cột tinh sạch

- Cho dung dịch NTI vào từng ống mẫu sản phẩm PCR (tỉ lệ 2:1) - Hỗn hợp được trộn đều và cho vào từng cột bằng pipet.

- Cho các cột vào ly tâm 12000rpm, 30s, 20C

- Đổ bỏ dịch thừa, cho dung dịch NT3 vào các cột. Ly tâm 12000rpm, 30s, 20C.

- Đổ bỏ dịch rửa. Rửa lại tiếp với NT3, ly tâm điều kiện trên.

- Đổ bỏ dịch rửa. Ly tâm 12000rpm, 1 phút, 20C.

- Chuẩn bị các ống eppendorf sạch. Cho các cột tinh sạch vào các ống epps đã ghi tên tương ứng.

- Cho thờm 15àl dung dịch Elution Buffer vào từng cột.

- Ly tâm 12000rpm, 1 phút, 20C.

29

- Loại cột; thu DNA đã tinh sạch trong các ống eppendorf.

- Giữ ở -20C.

2.3.4.5. Phương pháp phân tích trình tự

Gen 16S rARN của vi khuẩn XTS1 (~1300 bp) được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Việc giải trình tự được thực hiện bởi First Base (Singapore). Các trình tự

gen sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas version 2.4, đối chiếu với trình tự 16S rADN của các loài có liên quan hiện đã công bố trên cơ sở dữ liệu trình tự

của GenBank bằng công cụ BLAST Search.