Để xác định rõ kết quả thu được, tiến hành đo cường độ phát quang từ các giếng thí nghiệm bằng máy TD-20/20 Luminometer. Kết quả đo được biểu thị trong hình 3.6.
Từ đồ thị biểu thị cường độ phát quang đo ở các giếng thí nghiệm trong hình 3.6, có thể nhận thấy sau khi bổ sung dịch nuôi loại tế bào của chủng vi khuẩn XTS1 vào các giếng môi trường chứa Vibrio harveyi thì cường độ phát quang đo được là thấp nhất. Cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở giếng bổ sung dịch nuôi của chủng vi khuẩn CP1 cũng giảm khá thấp. Còn giếng bổ sung dịch nuôi của chủng vi khuẩn CP10 cường độ phát quang thay đổi không đáng kể.
37
Hình 3.6. Đồ thị biểu thị cường độ phát quang của Vibrio harveyi ở các giếng thí nghiệm xác định khả năng ức chế sự phát sáng liên quan đến quorum sensing ở V. harveyi của các VSV phân lập đƣợc. Các cột có chữ cái không giống
nhau thể hiện sự sai khác thống kê với P ≤ 0.05.
Hình 3.7. Hiệu quả ức chế phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của hai chủng vi khuẩn XTS1 và CP1
Phân tích hiệu quả ức chế phát quang sinh học của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 cho kết quả như hình 3.7. Kết quả chỉ ra chủng XTS1 có hiệu quả ức chế lên
a
b
c d
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Vh + XTS1 Vh + CP1 Vh + CP10 Vh
XTS1 + Vh CP1 + Vh
83.33±0.5
35±0.5
Hiệu quả ức chế (%)
Hiệu quả ức chế (%) Cườ
ng độ phát quan g
38
đến 83,33% (± 0.5), còn hiệu quả ức chế của chủng CP1 là 35% (±0.5) ở cùng thời điểm đo. Như vậy, 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1 đều có hoạt tính ức chế sự phát quang sinh học liên quan đến quorum sensing của vi khuẩn Vibrio harveyi chủng dại.
Từ kết quả phân lập và xác định khả năng ức chế phát quang sinh học cho thấy tỷ lệ các chủng vi sinh vật có hoạt tính ức chế quorum sensing của Vibrio harveyi trong tự nhiên còn thấp (299 chủng chỉ có 2 chủng có hoạt tính đối kháng).
Do đó, việc phân lập, tìm kiếm các chủng có hoạt tính ức chế sự phát sáng (liên quan đến quorum sensing) của vi khuẩn Vibrio harveyi là cần thiết.
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng VSV đối kháng
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Tiếp theo chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát sáng của Vibrio harveyi sau khi được bổ sung với dịch nuôi loại tế bào của 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính là
XTS1 và CP1 ở các nhiệt độ khác nhau.
Bảng 3.3 . Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng ức chế sự phát quang sinh học ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1.
Giếng
Nhiệt độ Vh Vh + XTS1 Vh + CP1
20C + - -
26C +++ - +
32C +++ - +
35C +++ - +
Ghi chú: Các kí hiệu: Vh + XTS1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào của XTS1. Vh + CP1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào của CP1. ĐC: giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi.
39
Rất sáng: (+++) Sáng mạnh: (++) Sáng yếu: (+) Không sáng: (-)
Kết quả cho thấy, độ sáng của Vibrio harveyi không thay đổi ở các điều kiện nhiệt độ 26C, 32C và 35C (giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi – ĐC), tuy nhiên ở 20C, vi khuẩn này hoạt động kém và phát sáng yếu. Hoạt tính ức chế sự
phát sáng ở Vibrio harveyi của các chủng XTS1 và CP1 ở 4 điều kiện nhiệt độ này khi quan sát bằng mắt thường là không thay đổi. Các giếng chứa V. harveyi có bổ
sung dịch nuôi của XTS1 đều không sáng khi quan sát ở thời điểm khoảng 12h (thời điểm Vibrio harveyi phát sáng mạnh nhất) sau khi tiến hành thí nghiệm. Còn các giếng có bổ sung dịch nuôi của CP1 khi quan sát bằng mắt thường cũng không thay đổi và đều cho ánh sáng yếu hơn giếng (ĐC) chỉ chứa Vibrio harveyi.
3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm thường sinh sống trong điều kiện môi trường kiềm. Ở điều kiện in vitro, với pH <6, pH ≥10, vi khuẩn này không phát triển. Để tìm hiểu khả năng ức chế của 2 chủng XTS1 và CP1 đối với sự
phát sáng của loài vi khuẩn này trên các điều kiện pH khác nhau (6.5, 8 và 9), chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.2.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng ức chế phát quang sinh học liên quan đến QS ở Vibrio harveyi của 2 chủng vi khuẩn XTS1 và CP1
Giếng
Độ pH
Vh Vh + XTS1 Vh + CP1
6.5 ++ - ++
8 +++ - +
9 +++ - ++
Ghi chú: Các kí hiệu: Vh + XTS1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào (DN) của XTS1. Vh + CP1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào (DN) của CP1. ĐC: giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi.
40
Rất sáng: (+++) Sáng mạnh: (++) Sáng yếu: (+) Không sáng: (-)
Sau khi tiến hành thí nghiệm khoảng 12h, chúng tôi quan sát bằng mắt thường độ sáng của các giếng. Kết quả cho thấy, ở pH 6.5, vi khuẩn Vibrio harveyi phát sáng kém hơn các giếng chứa môi trường LB 3% ở mức pH 8 và 9. Trong khi đó, chủng vi khuẩn XTS1 đều ức chế hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi ở các pH 6.5, 8 và 9 (các giếng đều không sáng). Còn chủng CP1 ức chế kém hiệu quả ở điều kiện pH môi trường 6.5 (các giếng đều sáng mạnh giống giếng đối chứng) và ở mức pH 8 và 9, CP1 ức chế khá hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi (độ sáng yếu hơn giếng đối chứng).
Như vậy, độ pH của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự phát sáng của Vibrio harveyi. Đặc biệt, ở điều kiện pH 6.5, vi khuẩn này phát sáng yếu hơn. Cũng trong điều kiện pH này, khả năng ức chế sự phát quang sinh học của XTS1 là vẫn hiệu quả, còn CP1 ức chế kém hiệu quả. Ở điều kiện pH cao hơn (8 và 9), Vibrio harveyi phát sáng mạnh, XTS1 ức chế hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi (các giếng đều không sáng). CP1 ức chế khá hiệu quả sự phát sáng của Vibrio harveyi (sáng yếu so với đối chứng) ở pH 8, còn ở điều kiện môi trường pH 9, CP1 không có khả năng ức chế sự phát sáng của Vibrio harveyi.
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) trong môi trường nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đối với khả năng ức chế sự
phát quang sinh học (QS) ở Vibrio harveyi của 2 chủng XTS1 và CP1, chúng tôi sử dụng môi trường LB với các nồng độ muối (NaCl) khác nhau: 1%, 3% và 5%. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.5.
Vibrio harveyi là vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao. Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, ở nồng độ 1% độ sáng ở giếng đối chứng chứa Vibrio harveyi là cao nhất.
Ở nồng độ 3% và 5%, Vibrio harveyi phát sáng mạnh nhưng không bằng nồng độ 1%. Khả năng ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của chủng XTS1 vẫn đạt hiệu quả cao ở cả 3 nồng độ muối (các giếng thí nghiệm TB, DN đều không sáng). Hiệu quả ức chế sự phát sáng ở Vibrio harveyi của CP1 ở nồng độ 3% và 5% có sự khác biệt, ở nồng độ 3% NaCl, CP1 ức chế khá tốt sự phát sáng của Vibrio harveyi, còn ở
41
nồng độ 1% và 5% NaCl, CP1 hầu như không có hoạt tính.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCl) đến khả năng ức chế của 2 chủng XTS1 và CP1 tới sự phát quang sinh học(QS) của Vibrio harveyi
Giếng Nồng độ NaCl
Vh Vh + XTS1 Vh + CP1
1% ++++ - ++
3% +++ - +
5% +++ - ++
Ghi chú: Các kí hiệu: Vh + XTS1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào (DN) của XTS1. Vh + CP1: giếng chứa Vibrio harveyi và dịch nuôi vi khuẩn loại tế bào (DN) của CP1. ĐC: giếng đối chứng chỉ chứa Vibrio harveyi.
Rất sáng: (++++) Sáng mạnh: (+++) Sáng yếu: (+) Sáng vừa: (++) Không sáng: (-)
Như vậy, ở các nồng độ muối (NaCl) 1%, 3% và 5%, khả năng ức chế sự
phát sáng sinh học liên quan đến quorum sensing ở Vibrio harveyi của chủng XTS1 đều có hiệu quả và không thay đổi mặc dù ở nồng độ NaCl 1% Vibrio harveyi phát sáng rất mạnh. Còn chủng CP1 mặc dù ức chế mạnh hơn ở điều kiện 3% NaCl nhưng nhìn chung hiệu quả ức chế kém hơn và không ổn định.