L ỜI NÓI ĐẦU
3.5Mật độ L.monocytogenes trong mẫu đồ uống đường phố khu vực
quanh Trường Đại Học Nha Trang.
Con đường nhiễm Listeriosis phổ biến ở người là ăn phải các thức ăn bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes. Vi khuẩn này đã tìm thấy sự hiện diện ở thịt nấu không chín, bơ sữa, các loại rau xanh rửa không sạch và hải sản.
Nguy cơ của lọai vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ độc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm não, nhiễm trùng huyết.
Tuy chỉ tiêu L.monocytogenes không có trong tiêu chuẩn đồ uống, nhưng thời gian qua trên thế giới xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do L.monocytogene. Đây thực sự là một điểm nóng cần quan tâm. Hơn nữa đối tượng trong nghiên cứu là các đồ uống được bảo quản lạnh – là môi trường mà L.monocytogenes có thể phát triển thuận lợi khi không có sự cạnh tranh của vsv khác. Đó là lý do tại sao nghiên cứu tiến hành kiểm tra chỉ tiêu L.monocytogenes trên đồ uống quan tâm.
Mật độ L.monocytogenes trong một số mẫu đồ uống đường phố được thể hiện qua bảng 3.9 và các bảng 4.1; 4.3; 4,3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7; 4.8 phụ lục 2.
Bảng 3.9: Mật độ L.monocytogenes trong mẫu đồ uống đường phố khu vực Trường Đại Học Nha Trang
Loại đồ uống Thời điểm lấy mẫu
Sữa đậu nành (MPN/ml) Nước ép rau má (MPN/ml) Nước ép cà rốt (MPN/ml) Nước ép cà chua (MPN/ml) Buổi sang KPH <3 KPH KPH Buổi chiều KPH 4,3 <3 KPH Trung bình KPH 3,7 <3 KPH
(-): Không phát hiện sự có mặt của vi khuẩn trong 25ml mẫu.
Nhận xét:
Listeria monocytogenes có ở khắp nơi trong tự nhiên, trong đất, nước…
Nghiên cứu phát hiện thấy trong mẫu nước ép cà rốt có sự hiện diện của
Listeria monocytogenes nhưng với mật độ nhỏ (<3MPN/ml), tỷ lệ nhiễm khuẩn là
1/6 mẫu kiểm. Mẫu sữa đậu nành và nước ép cà chua kiểm tra âm tính với
L.monocytogenes.
Trung bình trong mẫu nước ép rau má thu nhận buổi sáng L.monocytogenes
hiện diện với mật độ thấp (<3MPN/ml). Trong mẫu thu nhận buổi chiều hiện diện với mật độ lớn hơn (4,3 MPN/ml). Tỷ lệ nhiễm khuẩn trung bình là 5/6 mẫu kiểm tra.
Trong 4 loại đồ uống đường phố nghiên cứu, nước ép rau má có tỷ lệ nhiễm
L.monocytogenes lớn nhất (83%) sau đó đến nước ép cà rốt (17%), sữa đậu nành và nước ép cà chua âm tính với L.monocytogenes. Đặc biệt L.monocytogenes vẫn có thể tiếp tục phát triển tăng số lượng trong điều kiện bảo quản lạnh, vì vậy trong rau
nguyên liệu và nước ép rau má được bảo quản lạnh thì sự hiện diện của
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 1. Kết luận
Các mẫu thu nhận vào buổi sáng có mật độ các vsv kiểm tra thấp hơn mẫu thu nhận vào buổi chiều.
Tỷ lệ TSVKHK trong các mẫu kiểm đồ uống đường phố vượt ngưỡng QCVN 6-2: 2010/BYT cho phép 100% không đạt tiêu chuẩn. Trong đó số lượng TSVKHK trong sữa đậu nành trung bình là 3,0.105 cfu/ml; trong nước rau má là 2,4.105 cfu/ml; trong nước ép cà rốt là 1,9.104 cfu/ml; trong nước cà chua là 2,2.104 cfu/ml.
Coliform có tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép khá cao 67 – 100%. Trong đó, mật độ Coliform trong sữa đậu nành trung bình là 4,6.102 cfu/ml; trong nước rau má là 1,7.102 cfu/ml; trong nước ép cà rốt là 2,0.102 cfu/ml; trong nước cà chua là 3,2.101 cfu/ml.
Chỉ tiêu E.coli vượt ngưỡng cho phép với tỷ lệ cao nhất là 33% ở mẫu nước rau má. Trong đó, mật độ E.coli trong nước rau má, nước ép cà rốt là <1 cfu/ml; trong các mẫu sữa đậu nành và nước cà chua kiểm tra là không tìm thấy sự hiện diện của E.coli.
Chỉ tiêu S.aureus có tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép cao nhất ở sữa đậu nành là 100% và chiếm tỷ lệ thấp 0% ở mẫu nước ép cà chua, nước ép cà rốt. Trong đó, mật độ S.aureus trong sữa đậu nành trung bình là 4,7.102 cfu/ml; trong nước rau má là <1 cfu/ml.
TSNM – M có tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép cao nhất là 33%. Trong đó, mật độ TSNM – M trong sữa đậu nành trung bình là 2,0.101cfu/ml; trong nước rau má là 1,3.101 cfu/ml; trong nước cà chua là 1,7.101 cfu/ml. Mẫu nước ép cà rốt đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế (<10 cfu/ml).
L.monocytogenes âm tính trong 25ml mẫu kiểm tra, chiếm tỷ lệ 75%. Nghiên cứu thấy sự xuất hiện L.monocytogenes trong nước rau má với mật độ trung bình là 3,7 MPN/ml.
2. Đề xuất ý kiến
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguyên liệu, quy trình chế biến và thời gian bảo quản đồ uống đến mật độ vsv.
- Cần kiểm tra mẫu với số lượng lớn để có số liệu chính xác hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ môn Dinh dưỡng và An toàn thực phẩm, Trường Đại học Y Hà Nội, (1996), Dinh dưỡng và An toàn thực phẩm, NXB Y học Hà Nội, tr. 215. 2. Bộ môn Sức khoẻ Nghề nghiệp, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên
(2007), Dinh dưỡng và An toàn thực phẩm, NXB Y học Hà Nội, tr. 167. 3. Bộ Y tế (2008), Tài liệu hội nghị tổng kết chương trình mục tiêu Quốc gia
năm 2007 và triển khai kế hoạch chương trình mục tiêu Quốc gia năm 2008 về VSATTP, tr. 42, 44
4. Bộ Y tế, (2007), Tài liệu hội nghị triển khai đánh giá Pháp lệnh VSATTP-
Báo cáo tình hình thực hiện Pháp luật về VSATTP, tr.7
5. Bộ Ytế (2007), Dinh Tài liệu hội nghị triển khai đánh giá Pháp lệnh vệ sinh An toàn thực phẩm . tr.8-9
6. Hà Huy Khôi, Từ Giấy (1992), Dinh dưỡng và sức khỏe, NXB Y học, tr.138. 7. Lý Thành Minh, Cao Thanh Diễn, Kiến thức – thái độ – thực hành về vệ sinh
an toàn thức ăn đường phố ở thị xã bến tre năm 2007, Tạp chí y học TP.HCM, tập 12, phụ bản số 4, 2008.
8. Phạm Ngọc Thiều, Cây đậu tương: Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm,
NXB Nông Nghiệp.
9. Nguyễn Thị Thanh Hải, Nguyễn Minh Trí, Listeria gây nhiễm trùng qua thực phẩm và các phương pháp xác định hiện nay
10. Nguyễn Văn Tặng (2007), Công nghệ rượu bia và nước giải khát
11.Tống Văn Đản và Cs (2005), Thực trạng vệ sinh thức ăn đường phố và KAP người bán hàng tại 3 huyện trọng điểm phía nam tỉnh Bình Dương năm 2005, kỷ yếu hội nghị khoa học về VSATTP, tr.412 – 416.
12. Trần Linh Phước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục.
13. Trịnh Xuân Nhất, 2008, Nghiên cứu thực trạng ô nhiễm vi khuẩn thức ăn đường phố và một số yếu tố liên quan tại thành phố thanh hóa, Trung tâm học liệu Thành phố Thái Nguyên.
14.Viện Dinh dưỡng (1998), Dinh dưỡng Phòng chống các bệnh thiếu vi chất dinh dưỡng. Tr.53.
15. Bacteriological Analytical Manual (BAM)
16. Duangkamol Taemchuay1,21, Theera Rukkwamsuk3, Thavajchai Sukpuaram4,and Nongluck Ruangwises5. 2008. A study on antibacterial activity of crude extracts of Asiatic pennywort and water pennywort against Staphylococus aureus. KMITL Sci. J. Vol.8 No.2 (Section A).
PHỤ LỤC 1 Quy trình định lượng
1. 1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Hình 4.1 : Quy trình tóm tắt định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
Chuẩn bị mẫu
25ml mẫu/225ml BPW. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…
Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp. Chuyển 1ml
mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Ủ ở 350C / 24 giờ
Đếm những đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc/đĩa
Tính kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/ml) Rót vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
45 – 500C. Lắc cho mẫu phân tán đều trong môi trường
Thuyết minh: Pha loãng mẫu
Hình 4.2: Quy trình pha loãng mẫu Thao tác cấy
Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ ta cấy trộn 2 đĩa trên môi trường PCA.
Sau khi cấy, đợi đến khi thạch đông lại ta đem ủ ở 350C / 24 giờ.
Hình 4.4: Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên môi trường thạch PCA Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốcđược tính như sau:
Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩađã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 sốđếm lớn hơn 250, kết quảđược ghi: >2.5 x 107 CFU/g.
dụ ở nồng độ 10-1 sốđếm nhỏhơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g.
1.2 Coliform và E.coli
Hình 4.5: Quy trình tóm tắt định lượng Coliform, E.coli
Chuẩn bị mẫu
25ml mẫu/225ml BPW. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Chuyển 1ml mẫu vào ống chứa 10ml
LSB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại)
Ủ ở 350C / 24 giờ
Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) ở
mỗi nồng độ pha loãng Tra bảng Mac Crady
Cấy ống dương tính lên EMB Ủ ở
350C/24h
Chọn khuẩn lạc điển hình làm thử
nghiệm IMViC
Test IMViC ++--
Đếm số ống dương tính với E.Coli
Mật độ E.coli (cfu/ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mật độ Coliform
Thuyết minh:
Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB trong mỗi ống nghiệm có chứa ống durham, mỗi nồngđộ có 3 ống lặp lại,ủở 370C, 48 giờ. Ông sinh hơi là ống dương tính, tra bảng Mac Crady để xác định số lượng vsv.
Hình 4.6: Cấy theo phương pháp MPN
Hình 4.7: Coliform trên môi trường VRB-A Kiểm tra E.coli
Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh LSB sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủở 350C, 24 giờ.
Hình 4.8: E.coli trên môi trường thạch EMB
Thử nghiệm IMViC
Hình 4.9: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red. Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống nghiệm.
Tính kết quả
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
1.3Staphylococus aureus
Hình 4.10: Quy trình tóm tắt kiểm tra S. aureus
Chuẩn bị mẫu
25ml mẫu/225ml BPW. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Cấy 1ml mẫu vào BP + egg yorks. Trang đều
dịch mẫu trên bề mặt thạch (mỗi nồng độ 3 đĩa).
Đếm những đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc đặc trưng/đĩa
Test coagulase khẳng định. Xác định tỷ lệ
S.aureus
Tính toán mật độ S.aureus (cfu/ml)
Thuyết minh: Thao tác cấy
Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ ta cấy trang 2 đĩa trên môi trường BP có bổ sung egg yorks.
Sau khi cấy, đợi đến khi thạch đông lại ta đem ủ ở 350C / 48 giờ.
Hình 4.11: S.aureus trên môi trường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thạch BP bổ sung egg yorks
Thử nghiệm sinh hóa coagulase
Tiến hành: chọn 10 khuẩn lạc nghi ngờ đem test trên thạch máu, xác định phần trăm
S.aureus.
Hình 4.12 : S.aureus trên môi trường thạchmáu Vòng tan huyết
1.4 Nấm men và nấm mốc
Hình 4.13: Quy trình định lượng nấm men nấm mốc Chuẩn bị mẫu
25ml mẫu/225ml peptone 0,1%. Đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3
Cấy trộn 1ml mẫu vào 3 đĩa PCA bổ
sung kháng sinh (mỗi nồng độ 2 đĩa).
Ủ ngửa đĩa ở 250C /5-7 ngày
Quan sát và đếm số khuẩn lạc
1.5Listeria
Hình 4.14: Quy trình định lượng L.monocytogenes Thuyết minh:
Hút 25ml mẫu cho vào bao chứa 225ml BPW
Chuẩn bị 9 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường làm giàu BLEB và 2 ống (9ml/ống) nước muối sinh lý đã được vô trùng.
Mỗi mẫu 9 ống với 3 nồng độ pha loãng bâc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 103. Pha loãng bâc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ bao chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý đươc 10-2 và từ ống 10-2 hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3. Cứ mỗi nồng độ hút 1ml cho vào 3 ống nghiệm.
Chuẩn bị mẫu
25g ml/25ml BPW
Đồng nhất
Ủ 48h/ 300C Cấy trên dãy MPN
Cấy ria trên môi
trường OXA Ghi nhận ống (+) với Listeria monocytogenes -Tan máu -Manitol (-) -Rhamnose (+) -Xylose (-) Esculin (+) Test định danh Tra bảng Mac Crady
Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh thuộc dãy MPN
Thuyết minh:
Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hinh 4.15: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải) Ủ 30°C/ 48 giờ
Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa Thạch OXA
Khuẩn lạc có Esculin (+) Khả năng lên men đường và tan máu
Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng) và theo dõi thường xuyên.
Hình 4.16:: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh)
Thử catalase
Listeria monocytogenes dương tính.
Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.
Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, L.monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. Monocytogenes,
Thử khả năng tan huyết
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch OXA cấy chuyển sang môi trường thạch máu. Ủ 370C trong 24 28h.Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc
L.monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung huyết
dạng β.
Hình 4.17: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu
Nhận xét: Vòng tan máu bê-ta quanh khuẩn lạc do tan tế bào máu, tạo vùng trong, có màu vàng
Tra Bảng Mac Crandy
Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sau đó tra bảng Mac Crandy để suy ra mật độ VSV.
Hình 4.18: Tra bảng Mac Crandy để suy ra mật độ Bảng Mac Crady LƯƠNG MẪU CẤY/ỐNG LƯỢNG MẪU CẤY/ỐNG 0,1 0,01 0.001 MPN/g 0,1 0,01 0,001 MPN/g 0 0 0 <3,0 2 2 0 21 0 0 1 3 2 2 1 28 0 1 0 3 2 2 2 35 0 1 1 6,1 2 3 0 29 0 2 0 6,2 2 3 1 36 0 3 0 9,4 3 0 0 23 1 0 0 3,6 3 0 1 38