Hình 8: Quy trình sản xuất vaccine HPV qua kỹ thuật chuyển gen
Gardasil là một loại vắc-xin tái tổ hợp, như trong hình trên các loại vắc- xin. Gardasil tái tổ hợp được thực hiện bằng cách lấy gen mã hóa cho các protein capsid của các loại HPV 6, 11, 16, 18 và chèn chúng vào men vector biểu hiện, đó là tròn mảnh DNA có chứa các trình tự cụ thể cho phép bản dịch của những gen vào protein. HPV gen mã hóa protein được thể hiện trong các vectơ men để tạo ra một lượng lớn protein, sau đó được tinh chế và sử dụng vắc-xin.
Nhóm 6 20
Các phương pháp tinh sạch HPV 16 L1 tái tổ hợp.
2.4.1 Nguyên liệu & phương pháp:
Môi trường YPDG, đệm sucrose
S. cerevisiae Y2805 chứa plasmid YEGa-HPV 16
Nuôi cấy 48h, lắc 300C
Dịch phân
Siêu ly tâm Tủa amonium sunfate
Sắc ký kích trước-loại trừ
Sắc ký trao đổi cation 2.4.2 Kết quả:
2.4.2.1 Sự phụ thuộc của sản xuất HPV 16 protein L1 trên nguồn carbon:
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon trong sản xuất protein HPV 16 L1, sử dụng 4 biến thể của môi trường YPDG: điều kiện 1 (1% glucose, 1%
galactose), điều kiện 2 (0% glucose, 4% galactose), điều kiện 3 (0,5% glucose , 3,5% galactose), điều kiện 4 (1% glucose, 3% galactose).
Tất cả các môi trường có chứa 1% chiết xuất nấm men và 2% peptone.
Sản phẩm HPV 16 L1 phân tích bởi Western blotting trong điều kiện 4% carbon cao gấp 2,2 - 2,7 lần trong điều kiện 2% carbon. Hỗn hợp nguồn carbon tối ưu là 1% glucose và 3% galactose (điều kiện 4); cường độ band với 1% glucose và 3%
galactose là cao hơn 23% so với 4% galactose.
Nhóm 6 21
Kết quả này cho thấy hàm lượng carbon cũng như tỷ lệ giữa glucose và galactose ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất HPV 16 L1.
Nhóm 6 22
Sự phụ thuộc của HPV 16 L1 ở S.cerevisiae trên nguồn carbon.
Cường độ band của protein L1 ứng với 4 điền kiện nguồn carbon, cường độ band tăng khi hàm lượng carbon tăng từ 2% lên 4%, nguồn carbon tối ưu là 1% glucose & 3% galactose.
2.4.2.2 Tối ưu hóa tinh sạch HPV 16 L1:
Siêu ly tâm sử dụng đệm sucrose:
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 trên hàm lượng của sucrose trong đệm sucrose như sau: hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 sử dụng đệm sucrose 40% trong 6h (phương pháp b) là 27%, sử dụng đệm sucrose 45% trong 10h (phương pháp a) là 18,1%. Tuy nhiên, độ tinh khiết của protein L1 sử dụng phương pháp (a) cao hơn so với phương pháp (b). Do đó, tăng hàm lượng sucrose làm tăng độ tinh khiết nhưng giảm hiệu suất thu hồi.
Tủa Ammonium sulfate:
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi HPV 16 L1 vào hàm lượng ammonium sulfate sử dụng (40%, 45% và 50%) được phân tích bởi SDS-PAGE và Western blotting. Hiệu suất thu hồi bằng cách sử dụng tủa ammonium sulfate là 78,3%
trong khi sử dụng siêu ly tâm (a) và (b) tương ứng là 18,1% và 27%. Những kết quả này chứng tỏ 45% ammonium sulfate là tối ưu cho thu hồi L1 từ dịch phân tế bào và tủa ammonium sulfate hiệu quả hơn siêu ly tâm sử dụng đệm sucrose.
Sắc ký kích thước – loại trừ (size – exclusion chromatography):
Sắc ký kích thước – loại trừ sử dụng cột kích thước Sephacryl S-1000. Các phân đoạn thu được kiểm tra tại bước sóng 280nm và phân tích bằng SDS-PAGE và Western blotting. Protein L1 (55,9 kDa) được phát hiện trong các phân đoạn
Nhóm 6 23
42-74. Độ tinh khiết của HPV 16 L1 trong các phân đoạn 42-54 cao hơn trong các phân đoạn 56-70.
Sắc ký trao đổi cation:
Các phân đoạn 42-54 hay tất cả phân đoạn thu được từ sắc ký kích thước- loại trừ được cho vào cột trao đổi cation Poly-Prep sử dụng đệm có chứa 0,1 M NaCl. Hiệu suất thu hồi của HPV 16 L1 được xác định bởi SDS-PAGE, ELISA và Western blotting. Độ tinh khiết cuối cùng trong mỗi trường hợp là 98,5-100%.
Trong phương pháp (a), các phân đoạn 42-54 từ sắc ký kích thước-loại trừ được thu nhận và đem sắc ký trao đổi cation. Độ tinh khiết của các mẫu trong phương pháp (a) là 19,2% (mức cao nhất của độ tinh khiết), cột được rửa bằng đệm có chứa 0,35 M NaCl. Các mẫu thu được bằng phương pháp (b) và (c) có chứa nhiều tạp hơn. Sử dụng một bộ đệm rửa mới có chứa 0,6 M NaCl để loại bỏ các tạp chất. Độ tinh khiết của HPV 16 L1 đã tăng từ 1% đến 98,5% theo phương pháp (c). Sắc ký trao đổi cation được thực hiện bằng phương pháp (a), (b) và (c).
Kết quả tinh sạch bằng các phương pháp (a), (b) và (c) được hiển thị trên gel SDS-PAGE tương ứng (A), (B) và (C); làn 1: các phân đoạn thu nhận từ sắc ký kích thước - loại trừ; làn 2: không ràng buộc; làn 3: qua rửa; làn 4: eluted.
Protein HPV 16 L1 tách bằng phương pháp (c) phát hiện bằng Western blotting (D).
Tự lắp ráp các protein tinh khiết HPV 16 L1 thành VLPs:
HPV 16 L1 tinh chế bằng phương pháp (c) tự lắp ráp thành VLPs khác nhau, đường kính từ 35 nm đến 64 nm với đường kính chính 49 nm. Hiệu suất thu hồi bằng các phương pháp (a), (b) và (c) tương ứng là 1,9%, 10,2% và 30,6%
. Những kết quả này chứng tỏ rằng tủa ammonium sulfate thì hiệu quả cho thu
Nhóm 6 24
hồi HPV 16 L1, và các tạp chất từ bước này có thể được loại bỏ bằng cách tối ưu sắc ký kích thước-loại trừ và sắc ký trao đổi cation.
Nhóm 6 25
Như vậy điều kiện tối ưu để sản xuất và tinh sạch protein HPV 16 L1 là nuôi cấy chủng nấm men S. cerevisiae Y2805 chứa plasmid YEGa-HPV 16 L1 trong môi trường YPDG với nguồn carbon 4% (1% glucose và 3% galactose), tủa protein L1 sau khi dịch phân bằng ammonium sunfate (phương pháp c), sau đó đem sắc ký kích thước– loại trừ và sắc ký trao đổi cation thu được protein HPV 16 L1 tinh khiết có khả năng tự lắp ráp thành VLPs, thành phần của vaccine ngừa HPV và ung thư cổ tử cung.