2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu thân và lá làm nguyên liệu nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học.
- Thân và lá cây được làm nhỏ, sấy khô ở 50oC, bảo quản trong túi nilong kín làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học.
- Nơi thu hái: Nghệ An.
- Thời điểm thu hái: tháng 11/2015.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
➢ Dụng cụ, thiết bị, máy móc:
- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.
- Máy cắt vi phẫu cầm tay, dao, bộ dụng cụ nhuộm tiêu bản.
- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn, phiến kính, lam kính,….
- Kính hiển vi quang học Leica.
- Máy cô quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi).
- Đèn tử ngoại.
- Cột sắc ký dùng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 0,04-0,063mm (Merck).
- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C.
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXYS 115 HS.
- Máy đo phổ:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz (Viện Hóa học).
+ Phổ khối lượng (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy.
➢ Hóa chất, dung môi:
- Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: javel, cloralhydrat, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn.
- Dùng trong nghiên cứu thành phần hóa học: TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT diazo mới pha, FeCl3 5%, geletin 1%, chì acetat 5%, TT Lugol, dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 96%, n-hexan, diclomethan, ethyl acetat, methanol, n-butanol, toluen, acid acetic, acid formic,….
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Lấu thu hái ở Nghệ An.
- Giám định tên khoa học của mẫu.
- Mô tả đặc điểm vi học của mẫu.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu hóa học
- Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong thân và lá cây Lấu bằng các phản ứng hóa học.
- Khảo sát các thành phần có trong dịch chiết phân đoạn n-hexan của thân và lá cây Lấu bằng sắc ký lớp mỏng.
- Phân lập các thành phần có trong phân đoạn n-hexan của thân và lá cây Lấu bằng phương pháp sắc ký cột.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật
➢ Mô tả hình thái thực vật:
Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái cây Lấu theo phương pháp trong tài liệu [4].
➢ Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
Thu thập các mẫu cây Lấu ở Nghệ An. Các mẫu sau khi thu thập được xử lý và làm tiêu bản theo quy trình làm tiêu bản trong tài liệu [4]. Đối chiếu với các mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như:
- Cây cỏ Việt Nam [2].
- Từ điển cây thuốc Việt Nam [1].
- Cây thuốc và động vật ở Việt Nam [7].
- Thực vật chí Trung Quốc [21].
- Tiêu bản mẫu tại Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.
Nhờ chuyên gia giám định tên khoa học của cây. Các tiêu bản mẫu sau khi giám định tên khoa học được đưa vào lưu trữ tại Viện dược liệu và Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
➢ Nghiên cứu đặc điểm vi học:
- Cắt vi phẫu bằng dao và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [4].
- Quan sát cấu tạo vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột thân, bột lá bằng kính hiển vi, chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh theo phương pháp trong các tài liệu:
[4], [6].
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu hóa học
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu ở thân và lá Lấu bằng các phản ứng hóa học
Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [6], [5], [9]:
2.3.2.2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các chất phân lập được
- Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm lạnh, sử dụng dung môi là ethanol 96%. Dịch chiết ethanol được cất thu hồi dung môi, thu được cao đặc. Cao mềm được hòa lại với 1 lít ethanol 25% thu được dịch chiết ethanol. Dịch chiết ethanol được chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dichlomethan, ethyl acetat. Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi, thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao n-hexan (cao H), cao dichlomethan (cao D), cao ethyl acetat (cao E), cao nước (cao N).
- Khảo sát thành phần hóa học có trong dịch chiết phân đoạn n-hexan bằng phương pháp SKLM.
- Tiến hành phân lập các thành phần có trong dịch chiết phân đoạn n-hexan bằng phương pháp sắc ký cột [9], [5].
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13C-NMR, DEPT)… và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố.