CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp Green synthesis của nano bạc bằng dịch chiết dược liệu
AgNPs được tổng hợp theo phương pháp của Parashar và cộng sự, (2009). Cân khoảng 10g dược liệu khô cho vào bình tam giác 250ml, rồi cho 100ml nước cất, đun sôi hỗn hợp ở 60°C trong 5 phút. Sau khi đun sôi, lọc thu được dung dịch. Lấy 12ml lượng dung dịch trênthêm vào 88ml dung dịch AgNO30,001M, đun nóng ở 60°C trong 5 phút, dung dịch thu được có màu nâu. Dịch chiết này được lọc qua lưới nylon, tiếp theo là bộ lọc ưa nước Millipore (0,22μm) và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Tại mỗi thời điểm 6, 12, 24, 48, 72 giờ, dịch chiết được đo ở bước sóng 435nm [10].
2.2.2. Phương pháp định lượng tổng flavonoid theo quercetin
Hàm lượng tổng flavonoid theo quercetin được xác định theo phương pháp tạo màu với AlCl3 (Chang et al., 2002), bằng cách xây dựng đường chuẩn với chất chuẩn quercetin (QE). Hàm lượng tổng flavonoid theo quercetin được biểu diễn theo miligam đương lượng quercetin trên gram cao chiết (mg QE/g cao chiết) [6].
a) Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị chất chuẩn:Cân 5 mg chất chuẩn quercetin hòa tan trong 5ml EtOH 80% thu được dung dịch chuẩn quercetin nồng độ 1mg/ml. Pha loãng dung dịch chuẩn quercetin 1mg/ml để được các dung dịch có nồng độ lần lượt là 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125mg/ml.
Chuẩn bị mẫu thử:Cân khoảng 2g mỗi mẫu dược liệu của 5 mẫu ANP02, ANP03, ANP04, ANP13, ANP14 cho vào bình cầu, chiết 3 lần bằng máy siêu âm ở nhiệt độ 60oC bằng EtOH 80% với tỷ lệ dược liệu : dung môi
= 1:10. Lọc dịch chiết, định mức bằng EtOH 80% đến 100ml, đem cô quay chân không thu được cao dược liệu. Cao được sấy khô, hoà tan trong EtOH 80% và tiến hành phản ứng định lượng.
Xây dựng đường chuẩn:Với mỗi nồng độ tương ứng, lấy 0,5ml dung dịchtrên vào các ống nghiệm riêng biệt, rồi thêm lần lượt: 1,5ml ethanol 95%,
0,1ml AlCl3 10%, 0,1ml CH3COOK 1M và 2,8ml nước cất. Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đo màu ở bước sóng 415nm.Mẫu trắng thực hiện tương tự, nhưng thay AlCl3 bằng nước cất [3].
b) Định lƣợng flavonoid theo quercetin
Hàm lượng tổng flavonoid theo quercetin trong mẫu cao chiết được đo lường bằng hàm lượng quercetin đương lượng (QE) và được tính bằng công thức:
F = x N x H
Trong đó:
F:Hàm lượng tổng flavonoid theo quercetin (mg QE/g dược liệu khô) c: Giá trị x từ đường chuẩn quercetin (mg/mL)
V: Thể tích dịch chiết (mL)
m:Khối lượng cao chiết có trong thể tích (g) N: Độ ẩm của cao chiết
H: Hiệu suất chiết cao.
2.2.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóaDPPH
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 5,0mg của từng cao chiết, thờmchớnh xỏc 5ml DMSO được dung dịch 1000àg/mL. Tiến hành pha loóng để được cỏcdung dịch cú nồng độ 100àg/ml, 50àg/ml, 25àg/ml, 12.5àg/ml, 6.25àg/ml.
Chuẩn bị mẫu đối chứng dương: Cân chính xác khoảng 2,0mg quercetin, thờm lượng DMSO để được dung dịch cú nồng độ 1000 àg/mL.
Tiến hànhpha loóng để được cỏc dung dịch cú nồng độ 100àg/ml, 50àg/ml, 25àg/ml, 12.5àg/ml,6.25àg/ml.
Chuẩn bị dung dịch DPPH 150 àM: Cõn chớnh xỏc 29,57mg DPPH, hòa tanbằng 30ml Ethanol, bổ sung Ethanol đến vạch bình định mức 50,0ml,
được dungdịch DPPH có nồng độ 15mM. Hút chính xác 5,0ml dung dịch trên vào bình định
Tiến hành phép thử:
Hỗn hợp các mẫu được thiết kế như sau:
Mẫu thử: Hỳt chớnh xỏc 5àl MT+195àl DPPH Mẫu trắng: 5àl DMSO + 195àl DPPH
Mẫu đối chứng õm tớnh Blank: 5àl DMSO + 195àl MeOH Mẫu đối chiếu: 5àl Quercetin + 195àl DPPH
Hỳt chinh́ xỏc 5àl dung dịch mẫu thử cỏc nồng độ 1000àg/ml cỏc mõũ . Chấtthử được đưa vào các lỗ của đĩa 96 giếng. Lặp lại n=3 lần với mỗi mẫu để lấy giỏ trịtrung bỡnh. Thờm đồng loạt 195àl dung dịch màu tớm DPPH. Để trong bóng tối trongkhoảng 30 phút, ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau đó được đem đo quang ở máy đoquang Elisa ở bước sóng λ=490nm.
Hoạt tính chống oxy hóa được xác định:
Đối với những mẫu có I (%) tuyến tính theo nồng độ , tiến hành vẽ đồ thị tuyếntính y=ax+b đi qua tất cả các điểm (y: % ức chế; x: nồng độ).