2.1.1. Nguyên liệu
Cây Cỏ rươi lá bắc có hoa được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định tháng 11 năm 2020. Mẫu thực vật đã được ThS. Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu- Dược học cổ truyền, Trường Đại học
Y Dược, ĐHQGHN giám định tên khoa học là Murdannia bracteata (Phiếu giám định số: UMP-082021). Mẫu tươi gồm cả cây mang lá và hoa
2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu:
- Nước javen: Công ty Cổ phần Bột giặt & Hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam. Sản xuất theo tiêu chuẩn TCCS 96: 2009/HCĐG.
- Acid acetic: Công ty Xilong Scientific, Guangdong, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – ISO 14001 – OHSAS 18001.
- Xanh methylen: Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – 2000.
- Đỏ son phèn: Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc. Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – 2000.
- Nước cất.
Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết.
15
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, pha đảo RP-18 (Merck) cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm.
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm, pha thường silica gel 60 F254
(Merck), độ dày 0,2 mm; pha đảo silica gel 60 RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 110oC trong 1h.
2.1.2.2. Trang thiết bị
- Kính hiển vi soi vi phẫu gắn camera: Meiji Infinity 1 (Nhật Bản).
- Kính hiển vi soi nổi gắn camera: Optika (Ý).
- Sắc ký cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau tại Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Đại học Y Dược, ĐHQGHN.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong, ống nghiệm,… thuộc Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Đại học Y Dược, ĐHQGHN.
- Các thiết bị khác: cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy, tủ hút, đèn soi UV,… tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Đại học Y Dược, ĐHQGHN.
16
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp mô tả về đặc điểm thực vật
- Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích.
- Mô tả giải phẫu:
+ Thân, lá: Cắt, tẩy và nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép.
+ Soi bột: lên tiêu bản bột theo phương pháp giọt ép.
+ Quan sát cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số.
2.2.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
Mẫu lá cây Cỏ rươi lá bắc sau khi rửa sạch, hơi khô, làm nhỏ được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng bằng dung môi EtOH 80% (3 lần, mỗi lần 10 L), sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40oC trong vòng 30 phút. Lọc các dịch chiết EtOH thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết tổng trong nước cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc. Các phân đoạn n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cắn tương ứng: n-hexan và EtOAc. Phần dịch nước còn lại được cô cạn thu được phân đoạn nước.
Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ cắn EtOAc bằng phương pháp sắc ký cột. Các phân đoạn thu được trong quá trình phân lập được theo dõi bằng TLC.
+ Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.
Lựa chọn các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
17
+ Sắc ký bản mỏng: thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được qua 2 bước chính
+ Bước 1: Thực hiện đo nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), thiết lập bộ dữ liệu của các chất phân lập được.
+ Bước 2: So sánh bộ dữ liệu của các chất phân lập được với dữ liệu của các chất đã công bố.
18