CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chiết thành cao các chất có trong rễ cây mật nhân bằng phương pháp chưng ninh.
Sử dụng cho các loại dung môi khó bay hơi (nhiệt độ bay hơi cao) như nước.
Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học và phương pháp phân lập đều bắt nguồn từ cao chiết, vì vậy quá trình chuẩn bị cao chiết được xem như bước khởi đầu vô cùng quan trọng cho các nghiên cứu sau này. Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chưng ninh để phù hợp với mô hình sản xuất công nghiệp.
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu bột rễ mật nhân, mỗi mẫu 100gram đã được bào nhỏ.
Cho mẫu vào thiết bị chưng ninh sau đó thêm dung môi là nước vào theo tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là 20/1 (tức lượng nước đưa vào đối với mỗi mẫu là 2l). Tiến hành chưng ninh trong thời gian 3 tiếng. Sau đó, thu lấy dịch cao chiết, thực hiện lọc dịch chiết bằng thiết bị lọc chân không và tiến hành cô quay chân không với các thông số như sau:
+ Áp suất: 72mbar + Nhiệt độ 60oC
+ Số vòng quay : 55 vòng/ phút.
Cô tới khi cao chiết đạt được độ Bx=84 thì tiến hành dừng.
2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
2.3.2.1 Xác định hoạt tính kháng E.Coli
Nguyên tắc của phương pháp: Pha E.coli tới nồng độ E.coli: 5,1x105CFU/ml, sau đó nuôi cấy E.coli trong môi trường có bổ sung thêm mật nhân với liều lượng tăng dần, sau đó để yên trong vòng 1h ở 44oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 24h ở 44oC sau đó đếm số khuẩn lạc trên đĩa, nếu không có khuẩn lạc xuất hiện, tức dịch mật nhân có khả năng kháng khuẩn. Cách tiến hành dựa trên TCVN 7924-2:2008.
Trong phạm vi bài nghiên cứu này, em thực hiện 4 thí nghiệm trình bày ở dưới để xác định khả năng của dịch chiết rễ cây mật nhân.
Thí nghiệm 1: Cấy ở nồng độ d-3 (1ml E.coli và 1ml Mật nhân) để yên trong vòng 1h ở 44oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 24h ở 44oC sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Thí nghiệm 2: Cấy ở nồng độ d-3 (1ml E.coli và 2ml Mật nhân) để yên trong vòng 1h ở 44oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 24h ở 44oC sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Thí nghiệm 3: Cấy ở nồng độ d-3 (1ml E.coli và 4ml Mật nhân) để yên trong vòng 1h ở 44oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 24h ở 44oC sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Thí nghiệm 4: Cấy ở nồng độ d-3 (1ml E.coli và 6ml Mật nhân) để yên trong vòng 1h ở 44oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 24h ở 44oC sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
2.3.2.2 Xác định hoạt tính kháng S.aureus
Nguyên tắc của phương pháp: Pha S.aureus tới nồng độ S.aureus:
1,8x104CFU/ml, sau đó nuôi cấy S.aureus trong môi trường có bổ sung thêm mật nhân với liều lượng tăng dần, sau đó để yên trong vòng 1h ở 37oC, sau đó sử dụng pipet hút ra 1ml đổ đĩa để cấy trộn, sau 48h ở 37oC sau đó đếm số khuẩn lạc trên đĩa, nếu không có khuẩn lạc xuất hiện, tức dịch mật nhân có khả năng kháng khuẩn. Cách tiến hành dựa trên TCVN 4830-1:2005.
Thực hiện 3 thí nghiệm:
Cấy ở nồng độ d-5 (1ml S.aureus và 1ml mật nhân) để yên trong vòng 1h ở nhiệt độ 37oC hút lấy 1ml và đổ đĩa, đem cấy ở nhiệt độ 37oC trong vòng 48h sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Cấy ở nồng độ d-5 (1ml S.aureus và 5ml mật nhân) để yên trong vòng 1h ở nhiệt độ 37oC hút lấy 1ml và đổ đĩa, đem cấy ở nhiệt độ 37oC trong vòng 48h sau đó đếm số
Cấy ở nồng độ d-5 (1ml S.aureus và 9ml mật nhân) để yên trong vòng 1h ở nhiệt độ 37oC hút lấy 1ml và đổ đĩa, đem cấy ở nhiệt độ 37oC trong vòng 48h sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng Oxy hóa: Phương pháp DPPH (diệt gốc tự do)
Nguyên tắc của phương pháp: 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính kháng oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 517 nm [30].
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:
Tạo dung dịch các gốc tự do (DPPH 500mg/l): Cân 0,5g DPPH định mức bằng ethanol thành 1000ml dung dịch trữ DPPH.
Mấu đối chứng dương tính (acid acscorbic 1000mg/l): Cân 0,1g acid acscorbic định mức bằng ethanol thành 100 ml dung dich 1000mg/l.
Mẫu thí nghiệm (mẫu chiết): Cân 0,1g mẫu định mức bằng ethanol thành 100 ml dung dich 1000mg/l.
Tiến hành thí nghiệm
Mẫu thử và mẫu chứng dương được pha loãng ở các nồng độ theo bảng sau:
Bảng 2.2 Nồng độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chứng dương
C(mg/l) Trắng 50 100 150 200 300
V1mẫu/mẫu vitaminC
(àl)
0 250 500 750 1000 1500
V2ethanol (àl) 5000 4750 4500 4250 4000 3500
VDPPH (àl) 300 300 300 300 300 300
Đọc mẫu mix được trên máy quang phổ UV tại bước sóng 517 nm.
Cách tính kết quả
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:
%DPPH= 100 x (ACT – ABS)/ACT
Trong đó:
ACT: Độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết.
ABS: Độ hấp thụ quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao.
2.3.4 Phương pháp thử độc tính cấp
Nguyên tắc của phương pháp: xác định liều LD50 - liều gây chết 50% động vật thí nghiệm theo phương pháp Behrens – Karber.
Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss (18-20g) đuợc cung cấp bởi cơ sở chăn nuôi Suối Dầu - Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang.
- Điều kiện chăm sóc: Động vật thí nghiệm được nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột
- Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa vào thử nghiệm.
- Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô 10 con, được uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 mg mẫu thử / kg chuột, với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,2ml/10g cân nặng. Quy định mức liều 1,2,3,4,5,6 theo thứ tự tăng dần.
Cách dùng: đưa mẫu thử nghiệm theo đường uống. Lấy thể tích mẫu thử theo qui định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.
- Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết mỗi lô trong 72 giờ.
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.
Hình 2.7 Mô hình nuôi chuột tại Huế và cho chuột uống dịch cao chiết
2.3.5 Phương pháp đánh giá cảm quan
Đánh giá cảm quan đối với sản phẩm nước trà sữa mật nhân:
- Sử dụng phương pháp đánh giá so hàng đễ đánh giá mẫu nước trà sữa mật nhân.
- Tiêu chí để đánh giá ở đây là vị đắng của sản phẩm sau khi bổ sung thêm dịch chiết mật nhân. Người tham gia đánh giá cảm quan sẽ sắp xếp các mẫu với tỉ lệ dịch chiết mật nhân pha vào khác nhau theo thứ tự yêu thích nhất đến không thích, từ đó có thể xem xét chọn ra tỉ lệ phối chế thích hợp nhất cho sản phẩm.
2.3.6 Phương pháp nghiên cứu sản phẩm ứng dụng.
Sản phẩm ứng dụng được chọn là trà sữa mật nhân, được sản xuất từ ba nguyên liệu chính là lá chè xanh, sữa đặc, dịch chiết rễ cây mật nhân. Phối trộn để tìm ra tỉ lệ thích hợp nhằm giảm bớt vị đắng của dịch chiết mật nhân tạo sản phẩm mà người tiêu dùng có thể sử dụng rộng rãi.
Quy trình: rễ cây mật nhân-> bào nhỏ-> chưng ninh-> dịch chiết + nước chè thêm sữa đặc-> thanh trùng-> bảo ôn-> đóng chai.