- Thời gian: Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 4 năm 2019.
- Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại Trại nuôi cút của Hợp tác xã Bảo An thành phố Đà Nẵng và Phòng Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh thuộc Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại Học Đà Nẵng.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Phân chim cút 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
a. Thiết bị và dụng cụ trong phòng thí nghiệm
- Tủ cấy - Máy nuôi cấy lắc
- Tủ ấm CO2 - Máy ly tâm
- Nồi hấp vô trùng - Kính hiển vi
- Tủ sấy - Cân kĩ thuật
- Dụng cụ dùng trong phân tích: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy ria, que cấy trang, đèn cồn, pipet, eppendorf.
b. Thiết bị và dụng cụ ủ phân compost
- Bạt - Xẻng
- Nhiệt kế - Xe rùa
- Bút đo pH đất DM-13 2.2.3. Hoá chất
2.2.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống Bacillus licheniformis TT01
Sử dụng môi trường LB sau khi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm để phân lập và giữ giống Bacillus licheniformis TT01. Đối với môi trường LB rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng.
Peptone 10g
Yeast Extract ( Cao Nấm Men) 5g
NaCl 10g
Nước cất 1000lít
2.2.3.2. Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme amylase, protease, cellulase
Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme amylase, protease, cellulase sau khi hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng.
Môi trường khảo sát enzyme amylase:
NaNO3 3g/l
K2HPO4 1g/l
MgSO4 0.5g/l
KCl 0.5g/l
FeSO4 0.1g/l
Tinh bột tan 10g/l
Môi trường khảo sát enzyme protease:
NaNO3 3g/l
K2HPO4 1g/l
MgSO4 0.5g/l
KCl 0.5g/l
FeSO4 0.1g/l
Casein 10g/l
Môi trường khảo sát enzyme cellulase:
NaNO3 3g/l
K2HPO4 1g/l
MgSO4 0.5g/l
KCl 0.5g/l
FeSO4 0.1g/l
CMC 10g/l
Một số hoá chất khác - Cồn 70o
- HCl 1M, NaOH 1M, H2O2 30%
- Chế phẩm vi sinh EM, FBP 2.3. Sơ đồ thí nghiệm
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, tôi bố trí thí nghiệm như sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm
Các thí nghiệm ủ phân
Phân chim cút Chủng Bacillus licheniformis TT01
Thu gom
Xử lý sơ bộ
Tạo chế phẩm Bio-MS1 Ủ phân
(phụ phẩm: bã nấm)
Bio-MS1 TN1 TN2 FBP
TN3 EM
Không có CPVS ĐC
Giữ giống Bacillus licheniformis TT01 Hoạt hoá Bacillus licheniformis TT01
Nuôi tăng sinh khối Bacillus licheniformis TT01
Khảo sát khả năng
sinh enzyme ngoại bào Khảo sát khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella
Phân lập Định danh
Phân hữu cơ vi sinh Đảo trộn
Đánh giá chất lượng phân theo TCVN 7185:2002 Sử dụng, đóng gói,
bảo quản
2.4. Phương pháp phân lập, test sinh hoá a. Phương pháp phân lập vi sinh vật
VSV hiện diện trong tự nhiên ở các dạng quần xã gồm nhiều quần thể. Việc nghiên cứu một quần thể VSV nhất định sẽ phụ thuộc vào khả năng phân lập, làm thuần tế bào, khả năng giữ giống dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện trên chủng thuần.
Phần lớn các phương pháp phân lập và làm thuần các chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế cho chủng quan tâm.
Với chủng VSV phân lập từ phân chim cút, tôi chọn môi trường LB để phân lập và làm thuần VSV.
Mẫu phân chim cút sau khi lấy từ Trang trại nuôi chim cút của Hợp tác xã Bảo An sẽ trải trực tiếp lên môi trường LB rắn, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C. Sau 24h quan sát và chọn các khuẩn lạc đơn đem đi làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần liên tiếp (3-4 lần) trên đĩa môi trường LB.
Thử nghiệm Gram
Phương pháp nhuộm Gram
Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram.
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu. Còn VK Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn sẽ bị hoà tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin.
Như vậy, sau khi nhuộm, VK Gram âm có màu hồng đỏ, còn VK Gram dương có màu tím.
Các bước thực hiện:
Nhỏ sinh khối Vk nuôi cấy trên môi trường LB lên lam kính sạch (nếu mật độ vi khuẩn quá dầy đặc thì có thể pha loãng ra) cố định tiêu bản VK bằng ngọn lửa đèn cồn.
Ngoài ra, ta cũng có thể sử dụng que cấy thu khuẩn lạc đơn từ đĩa môi trường LB, dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch.
Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thể (Crytal Violet) trong 3 phút, rửa lại bằng nước.
Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước.
Rửa mẫu bằng ethanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước.
Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fuschin Ziehl trong 30-60 giây, rửa lại bằng nước.
Để khô, quan sát sự bắt màu của VK dưới kính hiển vi.
b. Phương pháp test sinh hoá
Khả năng di động
Nguyên tắc: VK có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiên mao (flagella).
Đây có thể là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt các VSV.
Thực hiện: Thử nghiệm trong môi trường thạch mềm. Nếu VK mọc theo đường cấy và lan ra cả 2 bên thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu VK chỉ mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thì không có khả năng di động.
Khảo sát hoạt tính Catalase
Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2Ovà giải phóng O2, gây hiện tượng sủi bọt khí.
Thực hiện: Nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển trên bề mặt thạch. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.
2.5. Phương pháp giữ giống
a. Giữ giống bằng phương pháp cấy truyền
Sử dụng phương pháp giữ giống vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng LB trong ống nghiệm. Sử dụng que cấy ria cấy các khuẩn lạc của giống theo đường ziczac.
Dùng nút bông vô trùng đậy kín ống nghiệm. Giống được giữ trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4-50C.
b. Giữ giống bằng phương pháp bảo quản lạnh sâu
Sau khi thu được chủng thuần đem tăng sinh trên môi trường LB và giữ giống với Glycerin 15% trong ống eppendorf, bảo quản trong điều kiện -200C.
2.6. Phương pháp khảo sát các đặc điểm sinh hoá
a. Khảo sát hoạt tính enzyme amylase, protease, cellulase ngoại bào Enzyme amylase
Amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành đường (đường đơn, đường đôi, hay dextrin phân tử lượng lớn). Lượng tinh bột còn lại phản ứng màu với iod. Xác định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa: Hoạt tính amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi lml dịch enzyme (hay lmg nguyên liệu chứa enzyme) trong 1 phút & điều kiện chuấn 50°C, pH 6.
Enzyme protease
Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phầm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin thì Tyrosine chiếm đa số. Xác định Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thủ folin, từ đó xác định đuợc hoạt độ enzyme protease theo định nghĩa: Hoạt độ của protease được biểu thị là số pmol Tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 ml dung dịch hay l mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5°C, pH 7,6).
Enzyme cellulase
Cho cellulase tác dụng với cơ chất là CMC, sản phầm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin thì Tyrosine chiếm đa số. Xác định Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thủ folin, từ đó xác định được hoạt độ enzyme cellulase theo định nghĩa: Hoạt độ của cellulase được biểu thị là số pmol Tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 ml dung dịch hay lmg hỗn hợp chứa cellulase trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5°c, pH 7,6).
Cách tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme của amylase, protease, cellulase được tiến hành chung như sau:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt tính enzyme. Đun nóng môi trường, rót vào đĩa Petri với lớp thạch dày khoảng 1cm. Đục các lỗ thạch với đường kính 1,25cm trên bề mặt thạch. Các lỗ thạch cách nhau 2-3cm để dễ dàng cho việc quan sát đường kớnh vũng phõn giải. Dựng micropipette hỳt 150àl dịch nuụi cấy thụ cú chứa vi
H = D - d
sinh vật cần kiểm định trong môi trường dịch thể đã được lọc hay ly tâm nhằm loại bỏ sinh khối cho vào các lỗ thạch. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở tủ lạnh trong 2 giờ. Sau đó các đĩa được ủ ở 320C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ thì đọc kết quả. Hoạt tính enzyme ngoại bào được xác định bằng sự hiện diện của vòng phân giải. Đường kính vòng phân giải được tính như sau:
Trong đó: H: đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ.
D đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ).
d: đường kính lỗ.
2.7. Phương pháp tạo chế phẩm
Cho 200 ml môi trường LB được chuẩn bị trong các bình thủy tinh tròn có dung tích 500ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, trong vòng 21 phút. Để nguội môi trường trong tủ cấy. Tiếp giống theo tỷ lệ 3%. Khử trùng nút bông và miệng bình thủy tinh dưới đèn cồn. Đóng nút bông của bình thủy tinh, quấn chặt miệng và cổ bình thủy tinh bằng parafilm. Cho bình vào lắc ở 30-350C, 150 vòng/phút, trong vòng 24-30h.
2.8. Phương pháp thực nghiệm ủ phân
Phân chim cút được thu gom tại các chuồng nuôi chim của Hợp tác xã Bảo An – Thành phố Đà Nẵng. Bã nấm được thu gom tại trại nấm và được cắt nhỏ khoảng 5-7cm. Thực nghiệm ủ phân được thực hiện theo quy mô hộ chăn nuôi gồm 3 công thức (bảng 2.1) với 3 lần lặp lại và được bố trí ngẫu nhiên.
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh ủ phân chim cút và bã nấm Công thức Vật liệu (% khối lượng) Chế phẩm
CT1 60% bã nấm + 40% phân chim cút Bio-MS1 CT2 60% bã nấm + 40% phân chim cút FBP CT3 60% bã nấm + 40% phân chim cút EM
ĐC 60% bã nấm + 40% phân chim cút Không dùng chế phẩm Tiến hành
Mỗi đống ủ chứa khoảng 300kg vật liệu (180 kg bã nấm + 120 kg phân chim cút). Bã nấm và phân chim cút được trộn đều rồi rải thành lớp dày khoảng 30cm trước khi tưới dịch CPVSV, làm liên tục đến khi hết khối lượng vật liệu cần dùng trong một
đống ủ. Sau đó dùng bạt che phủ trên bề mặt đống ủ. Với công thức đối chứng, tiến hành như các công thức khác nhưng dùng nước sạch thay cho CPVSV.
Trộn đều khoảng1 lít chế phẩm vi sinh vào đống ủ sao cho đạt độ ẩm 40-50%. Ủ thành đống khoảng 10 ngày đảo trộn 1 lần.
Hiệu quả của các CPVSV trên phân chim cút và bã nấm được theo dõi, đánh giá thông qua một số chỉ tiêu nhiệt độ đống ủ và chất lượng phân ủ qua mỗi lần đảo trộn.
Sau thời gian ủ tiến hành lấy mẫu đi phân tích.
2.9. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thống kê bằng phần mềm excel.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN