CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.3.4. Tiến hành thí nghiệm theo quy trình
Các hóa chất để tiến hành thí nghiệm theo quy trình nêu trên đuợc chúng tôi thực hiện theo tỉ lệ nhu sau:
Tỷ lệ giữa Ca2+ : sodium alginate = 1 : 4.2.[36]
Tỷ lệ giữa HPCD : sodium alginate = 1 : 8.[1]
Tất cả các thí nghiệm đều lấy theo tỷ lệ khối luợng, và chúng tôi chọn sodium alginate làm chất chuẩn để tính toán số liệu của các hóa chất còn lại.
Bảng 2.2. Khối luợng và thể tích các hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng Khối luợng (mg) Thể tích (ml)
Sodium alginate (6mg/ml) 48mg 8ml
Canxi clorua (6.5mg/ml) 11.7mg 1.8ml
HPCD (1.6mg/ml) 6mg 3,8ml
• Khảo sát % của anastrozole trong hệ Alginate-HPCD-Anastrozole
Chúng tôi khảo sát ở các % là: 1%, 5%, 10%, 20% anastrozole.
% của anastrozole trong hệ alginate-HPCD-anastrozole được xác định theo công
thức:
% anastrozole = —- - - -- --- (1)
mALG+mHPCD+x
Trong đó: mALG: khối lượng của alginate
mHPCD: khối lượng HPCD.
x: khối lượng của anastrozole.
Dựa vào công thức trên (1), chúng tôi có được bảng số liệu như sau:
Bảng 2.3. Khối lương và thể tích anastrozole ở các tỷ lệ khảo sát
% anastrozole Khối lượng
anastrozole
(mg)
Thể tích anastrozole (ml)
Tỷ lệ HPCD/alginate
Tỷ lệ
Ca2+/alginate
1% anastrozole 0.54mg 0.3ml
1/8 1/4.2
5% anastrozole 2.7mg 1.5ml
10% anastrozole 6mg 3.3ml
20% anastrozole 13.5mg 7.5ml
Hình 2.3. Mẫu gel nano HPCD-alginate-anastrozole (các tỷ lệ khảo sát) sau khi ly tâm.
2.3.5. Phương pháp phân tích sản phẩm
> Phân tích hàm lượng anastrozole trong mẫu nước ly tâm bằng HPLC
Để đánh giá hiệu quả tạo phức của vật liệu composite với thuốc trị ung thư anastrozole, chúng tôi dùng phương pháp xác định hàm lượng anastrozole thất thoát trong các mẫu nước ly tâm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Điều kiện phân tích:
Thể tích tiêm: 10 pl
Cột sắc ký: C18 150mm x 4.5mm x 5pm.
Tốc độ dòng: 1ml/1phút
Bước sóng phân tích: 215nm.
Pha động: acid formic/acetone nitrine tỷ lệ 6/4
Thời gian lưu: 6.89 phút
• Pha dung dịch chuẩn:
Pha dung dịch stock (100ppm) anastrozole trong dung môi acetone nitrine: Lấy 10mg anastrozole tinh khiết cho vào bình định mức 100ml, thêm 100ml acetone nitrine. Lắc đều.
Dung dịch 80ppm: Lấy 4ml dung dịch stock cho vào bình định mức 5ml, thêm 1ml acetone nitrine, lắc đều.
Dung dịch 50ppm: Lấy 25ml dung dịch stock cho vào bình định mức 50ml, thêm 25ml acetone nitrine, lắc đều.
Dung dịch 25ppm: Lấy 25ml dung dịch 50ppm cho vào ppm, thêm 25ml acetone nitrine, lắc đều.
Dung dịch 10ppm: Lấy 1ml dung dịch stock cho vào bình định mức 10ppm, thêm 9ml acetone nitrine.
• Dựng đuờng chuẩn:
Ôn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động. Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC từ nồng độ thấp đến cao. Dung đuờng chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak thu đuợc và nồng độ theo tuyến tính, ta đuợc phuơng trình bậc 1: y = ax + b (y: diện tích peak, x: nồng độ cần xác định)
• Tiêm mẫu thử:
Các mẫu nuớc ly tâm 1% anastrozole, 5% anastrozole, 10% anastrozole, 20% anastrozole tiêm lần luợt vào máy HPLC.
■ Luu ý: Sử dụng loại dung môi dùng cho HPLC. Các dung dịch trên đều phải lọc
qua milipore truớc khi tiêm mẫu. Sau khi phân tích xong làm sạch hệ thống HPLC bằng 100% dung môi hữu cơ trong 15 phút.
>Sử dụng phổ IR nhằm chứng minh sự có mặt của anastrozole trong mẫu nano HPCD-alginate-anastrozole.
Khảo sát các mẫu: Nano trống HPCD/alginate, 1% anastrozole, 5% anastrozole, 10% anastrozole, 20% anastrozole.
>Khảo sát sự ảnh huởng của % thuốc đến hình dạng, kích thuớc hạt nano
Sự phân bố, hình dạng và kích thuớc hạt nano đuợc xác định bằng phuơng pháp
đo TEM (transmission electron microscopy).
Khảo sát các mẫu: Nano trống HPCD/alginate, 1% anastrozole, 5% anastrozole, 10% anastrozole, 20% anastrozole.
>Sử dụng phương pháp DT-TGA để phân biệt nhiệt độ oxi hóa hoặc kết tinh của các chất , và nhiệt độ phân hủy của các nguyên tố có trong hệ nano HPCD- alginate-anastrozole.
Khảo sát các mẫu: Nano trống HPCD/alginate, 10% anastrozole.
>Đo thế zeta, kích thước hạt
Đo thế zeta xác định tương tác điện thế trên bề mặt hạt nano. Mục tiêu đo thế zeta nhằm chứng minh dung dịch được tao ra tồn tại ở hệ keo, các hạt nano phân tán trong dung dịch. Khảo sát các mẫu: Nano trống HPCD/alginate, 10% anastrozole.
Từ đó, chúng tôi tiến hành đo kích thước trung bình hạt nano. Các mẫu như sau: Nano trống HPCD/alginate, 5% anastrozole, 10% anastrozole, 20% anastrozole.
>Cách tính hàm lượng thuốc anastrozole có trong nano theo HPLC.
Dựa vào đồ thị hình 3.9, ta có được phương trình: area= 9.9925631*amt + 21.698984 (2)
(Trong đó: area là diện tích peak, amt là nồng độ anastrozole cần tìm (ppm)). Hàm lượng anastrozole có trong nước ly tâm được xác định bằng công thức:
mnước ly tâm (mg) = amt (ppm)* tổng thể tích nước ly tâm (L)
Hàm lượng anastrozole còn lại trong nano được xác định bằng công thức:
m anastrozole trong nano (mg) manastrozole bđ - mnước ly tâm
Phần trăm anas còn lại trong nano so với phần trăm anas ban đầu được xác định
theo công thức: m anas trong nano /m nano đông khô *100 (%).
Khả năng loading của anastrozole được tính theo công thức: % loading = manas
Dựa vào cách tính trên ta lập được bảng kết quả ở các tỷ lệ anas cần khảo sát (bảng 3.2).
trong nano/manasbđ*100 (%).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng % thuốc đến hiệu suất tổng hợp nano HPCD-alginate- anastrozole
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất sau đông khô ở các mẫu
Khối lượng ban đầu
(mg)
Khối lượng sau đông khô (mg)
Hiệu suất (%)
Nano trống 54 34.4 63.7
1% anastrozole 54.54 34.33 62.9
5% anastrozole 56.7 30.1 54.7
10% anastrozole 60 31 51.7
20% anastrozole 67.5 32.7 48
Hình 3.1. Biểu đồ hiệu suất tổng hợp nano HPCD-alginate-anastrozole. Phần trăm anastrozole được khảo sát lần lượt ở các tỷ lệ sau: nano trống (0%), 1%, 5%, 10%, 20% anastrozole.