CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG CARRAGEENAN
2.4.1. Xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô
Hình 2.6. Sơ đồ xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô và chuẩn bị mẫu rong
chiết carrageenan
Rong tươi sau khi thu về được xử lý theo phương pháp của Hellebust
và Craige (1978) [14], cân 100 g mẫu rong tươi nghiền với ethanol 80 %, lọc
sơ và phơi khô để được bột rong khô, xác định khối lượng bột rong khô. Thực hiện với từng mẫu rong ở 3 vị trí thu mẫu để lấy số liệu, sau đó trộn đều bột
100 g Rong tươi
Bột rong khô
Ethanol 80 %
Lưu trữ ở -20oC
Xác định tỉ lệ tươi/bột rong khô
Nghiền trong ethanol 80 %
rong khô của các mẫu và lưu giữ ở -20 oC. Xác định tỉ lệ rong tươi/bột rong khô bằng công thức:
Tỉ lệ rong tươi/bột rong khô = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑡ươ𝑖
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑏ộ𝑡 𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑘ℎô
2.4.2. Xác định hàm lượng carrageenan
Hàm lượng carrageenan chiết tự nhiên được tính theo công thức của Hellebust và Craige [14]:
Hàm lượng carrageenan (% bột rong khô) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑎𝑟𝑟𝑎𝑔𝑒𝑒𝑛𝑎𝑛
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 x 100
2.4.3. Xác định hàm lượng carbohydrate trong carrageenan
Hàm lượng carbohydrate được xác định theo phương pháp Dubois (1956) [17], dùng D-galactose làm chuẩn.
Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn ở các nồng độ galactose từ 20 đến 100 μg/mL, dung dịch mẫu (khoảng 100 - 120 μg/mL) cho vào mỗi ống nghiệm. Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,5 mL dung dịch phenol 5 %, lắc đều các ống nghiệm và giữ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 2,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm và giữ các ống nghiệm trong chậu nước lạnh trong 20 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm. Mỗi mẫu được đo 3 lần và tính giá trị trung bình.
2.4.4. Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan
Xác định hàm lượng 3,6-anhydrogalactose trong carrageenan theo phương pháp của Yaphe, Arsenault (1965) [18], dùng D-fructose làm chuẩn.
* Chuẩn bị dung dịch gốc:
a) Resorcinol: cân 150 mg (1,36 mmol) hòa tan trong 100 mL nước cất. Bảo quản trong chai màu, giữ trong tủ lạnh.
b) 1,1-Diethoxyethane hoặc acetal: Lấy 100μL (695 μmol) hòa tan trong 10 mL nước cất. Giữ trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh. Lấy 1 mL pha loãng với nước cất thành 25 mL trước khi trộn với thuốc thử.
c) Chuẩn D-fructose: cân 27 mg (150 μmol) hòa tan trong 50 mL của nước cất đã cho bảo hòa acid benzoic. Bảo quản trong tủ lạnh.
* Chuẩn bị dung dịch làm việc:
a) Thuốc thử resorcinol-acetal: thêm 100 mL HCl đậm đặc vào 9 mL dung dịch gốc resorcinol và thêm 1 mL của dung dịch gốc acetal đã được pha loãng, trộn đều. Chuẩn bị dung dịch này trước khi phân tích.
b) Chuẩn fructose: hòa tan 3 mL dung dịch gốc thành 100 mL trong nước cất. Chuẩn bị trước khi phân tích.
c) Chuẩn bị mẫu: cân 10 mg carrageenan hòa tan trong 100 mL nước cất nóng.
* Tiến hành phân tích:
Lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn, nước cất và dung dịch mẫu (khoảng 100- 120 μg/mL) cho vào ống nghiệm. Làm lạnh các ống nghiệm trong đá, sau đó thêm 2,5 mL thuốc thử resorcinol-acetal lạnh vào mỗi ống nghiệm. Trộn đều các ống nghiệm và làm lạnh các ống nghiệm lên 20 oC trong 4 phút, sau đó đun ở 80 oC trong 10 phút. Làm lạnh ống nghiệm trong chậu đá trong 1,5 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 555 nm trong 15 phút.
Số lượng của 3,6-anhydrogalactose được xác định với chuẩn D- fructose và nhân với giá trị 1,087 theo hệ số giữa 3,6-anhydrogalactose/D- fructose. Mẫu được phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình.
2.4.5. Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan
Xác định hàm lượng sulfate trong carrageenan theo phương pháp của Terho, Hartiala (1971) [19], dùng Na2SO4 làm chuẩn.
Thuốc thử:
* Dung dịch đệm BaCl2:
CH3COOH 2 M: 10 mL BaCl2 0,005 M: 2 mL
NaHCO3 0,02 M: 8 mL Ethanol 96%: 80 mL
* Dung dịch rhodizonate sodium: hòa tan 5 mg rhodizonate sodium trong 20 mL nước cất, thêm vào dung dịch 100 mg acid ascorbic và trộn đều cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm ethanol 96% vào hỗn hợp đến 100 mL. Dung dịch có màu nâu nhạt và có thể dùng sau 30 phút.
* Dung dịch sulfate chuẩn: 2 – 12 àg sulfate (Na2SO4 hoặc H2SO4)/0,5
mL.
* Tiến hành phân tích: lấy 0,5 mL mẫu chuẩn, mẫu polysaccharide (100 – 120 àg/mL) và nước cất cho vào cỏc ống nghiệm, thờm 2 mL ethanol 96 % vào các ống nghiệm, trộn đều. Sau đó, thêm 1,0 mL dung dịch đệm BaCl2 và 1,5 mL dung dịch rhodizonate sodium, trộn đều. Giữ các ống nghiệm trong tối
ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm trong
30 phút. Mẫu được phân tích 3 lần để tính giá trị trung bình.
2.4.6. Xác định các nhóm chức của carrageenan bằng phổ hồng ngoại
Màng được chuẩn bị bằng cách làm khô 5 mL (5 mg/mL) dung dịch mẫu trên bề mặt polyethylen ở 60 oC, trộn với KBr, ép thành viên đồng nhất
và đưa vào ngăn chứa mẫu của máy đo phổ. Các dải quang phổ được ghi lại trong khoảng từ 4000 đến 500 cm-1 trên máy quang phổ ALPHA chế độ Bruker, Đức.
Phổ Fourier-Transform Infrared (FT-IR) của mẫu carrageenan được đo trên máy Bruker mode ALPHA ở Viện Công nghệ Hóa học Tp. Hồ Chí Minh.