Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Phân tích trong phòng thí nghiệm
2.2.2.1. Xử lý mẫu và giám định tên loài rong Câu theo cách tiếp cận hình thái
Chuẩn bị mẫu vật: Các mẫu vật sau khi thu thập đƣợc rửa sạch loại bỏ bùn cát, sinh vật biểu sinh, tiến hành làm tiêu bản mẫu, chụp hình mẫu tươi và mẫu phân tích sinh học phân tử. Các mẫu rong đƣợc mã hóa và ép trên bìa cứng kích thước A3 hoặc A4, trên bề mặt mẫu vật phủ một lớp vải chống dính
và ép cố định lên tiêu bản giấy. Chụp hình tiêu bản mẫu với các đặc điểm liên quan đến hình thái gồm: Kích thước tản, cách phân nhánh, đế bám, cơ quan sinh sản. Tiến hành sấy tập tiêu bản mẫu trong tủ sấy Memmert ở nhiệt độ
600C trong 48 giờ.
Trên cơ sở các mẫu rong câu thu thập, tiến hành lựa chọn các mẫu điển hình có đầy đủ các đặc điểm để định loại theo phương pháp so sánh hình thái
và giải phẫu.
Phân loại hình thái để xác định loài, rong khô hay tươi được ngâm nước muối trước khi tiến hành cắt. Lựa chọn phần gốc, ngọn, thân và tảo quả (nếu có) cắt để quan sát. Trong quá trình cắt, rong đƣợc kiềm bằng nhíp ở tay trái, tay phải giữ dao lam cắt rong theo chiều ngang theo những lát mỏng. Chụp hình các mặt cắt ngang của gốc, thân, ngọn và cơ quan sinh sản của rong câu bằng kính hiển vi Olympus BX41 và kính hiển vi Olympus SZ51 làm cơ sở
dữ liệu cho phân loại hình thái.
Hình 2. 4. Mẫu rong câu thu tại điểm khảo sát
Mẫu được làm tiêu bản, phân tích định loại và lưu giữ tại Phòng Thí nghiệm Sinh thái, Viện Sinh học Nhiệt đới. Mẫu vật thu thập đƣợc định loại dựa trên tài liệu Nguyễn Hữu Dinh (1993), Lê Nhƣ Hậu và Nguyễn Hữu Đại (2010), Lê Nhƣ Hậu (2012).
2.2.2.2. Xử lý mẫu, phân tích di truyền rong Câu bằng chỉ thị phân tử
Chuẩn bị mẫu vật: trên cơ sở mẫu vật đã thu thập, xử lý. Lựa chọn các nhánh rong gần đỉnh sinh trưởng, tiến hành rửa và lau sạch các vật chất bám
và sinh vật biểu sinh. Sử dụng giấy pubpil lau sạch bề mặt của rong và lau khô mẫu vật. Cho mẫu vật vào túi nilon có chứa silicagel hút ẩm hoặc ống eppendorf có chứa hút ẩm. Định kì thay silicagel khi hạt chuyển sang màu hồng cho tới lúc mẫu vật khô hoàn toàn.
* Lựa chọn marker phù hợp để định danh loài
Trong 3 loại chỉ thị phân tử tiềm năng để phân loại rong câu là COI, COI-5P, rbcLS. Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ly trích DNA.
Mẫu đƣợc bảo quản trong silicagel đƣợc miêu tả ở nội dung trên đƣợc lấy ra để tách chiết DNA. Mẫu đƣợc cho vào nitơ lỏng, đƣợc nghiền nát trong tube ly tâm. Quy trình ly trích DNA đƣợc thực hiện theo bộ kit TopPURE®
PLANT DNA EXTRACTION KIT nhƣ sau:
Cho 30-100mg mẫu vào tube 1,5mL. nghiền nát mẫu bằng chày nghiền mẫu. Để đạt hiệu suất thu DNA cao nhất nên nghiền mẫu trong nitơ lỏng.
Thờm 400àL PLS1 bufer vào tube 1,5mL chứa mẫu ở trờn. Cho tiếp 10àL dung dịch Rnase A vào, vortex đều và ủ ở 65°C trong 30 phỳt. Vortex thường xuyên trong khi ủ.
Cho 130àL PLS2 buffer vào, trộn đều và ủ 5 phỳt trong tủ mỏt.
Ly tõm ở tốc độ 13.000 rpm trong 5 phỳt. Hỳt 300 àL dịch nổi chuyển sang tube 1,5 mL mới. Thờm vào 450 àL PBB buffer (tương đương 1,5 lần thể tích nổi), vortex đều.
Chuyển hỗn hợp sang cột Sillica đặt sẵn trong tube 2 mL (tối đa 600 àL). Ly tõm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phỳt. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới. Lặp lại với phần hỗn hợp còn lại.
Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Thờm 500 àL PWB buffer và ly tõm ở tốc
độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới. Lặp lại bước này 1 lần nữa.
Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút.
Chuyển cột sang tube 1,5 mL. Thờm 100àL EB bufer và ủ 1 phỳt ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới.
DNA đƣợc sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20°C.
Đoạn marker COI, COI-5P, rbcLS đƣợc khuếch đại bằng 3 cặp mồi tương ứng được thể hiện ở Bảng 2.1. Quy trình PCR được thực hiện trong tube PCR 0,2ml với hai bộ hóa chất khác nhau lần lƣợt đƣợc thể hiện ở bảng 2.2 và bảng 2.3. Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR của từng cặp primer đƣợc
cụ thể ở bảng 2.4.
Bảng 2. 5. Trình tự và vùng khuếch đại ba cặp mồi của ba marker COI, COI-5P,
rbcLS
a W= A or T, R= A or G, Y= C or T, N= A, T, C or G.
Bảng 2. 6. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO-
21105 Húa chất Nồng độ cuối Thể tớch sử dụng (àL)
5x MyTaq Reaction Buffer - 10
Template - 4
Primer R 20àM 4
Primer F 20àM 4
MyTaq HS DNA Polymerase - 1
Nước cất - 27
Tổng thể tích 50
Bảng 2. 7. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO-
25041
Húa chất Nồng độ cuối Thể tớch sử dụng (àL)
MyTaq Mix, 2x - 25
Template - 4
Primer R 20àM 1
Primer F 20àM 1
Nước cất - 19
Tổng thể tích 50
Marker Cặp mồi Trình tự cặp mồi 5’-3’ Kích
thước
Tham khảo
COI
COXI43F TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACT
⁓1500
bp
Geraldino
và ctv,
2006 COXI1549R AGGCATTTCTTCAAAGGTATGATA
COI-5P GazF2 CCAACCAYAAAGATATAGGTAC a ⁓700
bp
Lane và ctv, 2007
GazR2 GGATGACCAAARAACCAAAA a
rbcLS
rbcLS3F CATCGTGCTGGTAACTCTAC
? bp
Mattio và
ctv, 2008 rbcLSS97R
CATCTGTCCATTCWACACTAAC a
Bảng 2. 8. Chu trình nhiệt khuếch đại chung của 3 chỉ thị phân tử
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
Biến tính ban đầu 94 4 phút
Biến tính 94 1 phút
Bắt cặp 1 phút
Kéo dài chuỗi 72 2 phút
Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
Kết thúc phản ứng 4 ∞
Khi hoàn tất, sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng để tiếp tục qua bước điện di hoặc bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho thời gian lâu dài. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 1X. Sử dụng 5àL sản phẩm PCR trộn đều với 1 àL GelRed 6X và bơm vào từng giếng. Điện di ở hiệu thế 86V trong vòng 40 phút. Cuối cùng, gel được hiển thị dưới ánh đèn UV và lưu hình ảnh bằng điện thoại. Dựa vào hình ảnh gel, so sánh kết quả giữa các marker và đƣa ra kết luận marker nào hiển thị band đẹp và rõ nhất.
* Xây dựng cây phát sinh chủng loài
Sản phẩm PCR cho kết quả điện di tốt đƣợc đem đi giải trình tự ở công
ty 1st BASE ở Malaysia bằng phương pháp Sanger với nguyên tắc sử dụng deoxyribonucleotide triphosphate (ddNTPs) có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn và làm các điểm dừng để tổng hợp DNA ở các vị trí ngẫu nhiên. Các chuỗi trình tự thô sau khi trả về, đƣợc BLAST trên NCBI GenBank (www. blast.ncbi.nlm.nih.gov) để xác định loài và tìm trình tự tham chiếu với Max Score Total Score Total, Query Coverage gần bằng 100%, E-value khoảng 0, and Identity khoảng 100%.
Trình tự đoạn gen COI-5P được trình bày dưới dạng sắc ký đồ và được chỉnh sửa nucleotide nhiễu trong phần mềm Bioedit. Phần đầu và phần cuối của chuỗi DNA đã đƣợc cắt (khoảng 40 bp) và các nucleotide nào không chính xác hoặc không rõ ràng đã đƣợc sửa chữa hoặc cắt bỏ để có kết quả chính xác nhất. Tiếp theo đó, các chuỗi trình tự đƣợc sắp xếp và lập cây phát
40
sinh loài trong phần mềm MEGA X. Cây di truyền đƣợc tạo ra để xác định vị trí, mối quan hệ của mẫu thí nghiệm với các loài khác trên GeneBank.