Theo lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử Crick, (1958). Thông tin di truyền được mang bởi chuỗi DNA (hay RNA ở vài virus), qua các giai đoạn sao chép và dịch mã, sẽ được chuyển thành các trình tự amino acid của protein.
Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành từ các monomer là nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường 5 C) và một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở base nên người ta thường dùng từ “base” thay cho
“nucleotide”).
Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: Các purine gồm Adenine (A) và Guanine (G), các pyrimidine gồm Thymine (T), Cytosine (C) và Uracine (U). Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài.
Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). DNA cũng như RNA được tạo bởi nhiều nucleotid nối nhau nhờ các cầu nối ester. Tuy nhiên, có ba đặc tính của DNA giúp ta phân biệt DNA và RNA.
9 Đường của DNA là deoxyribose, trong khi đó đường của RNA là ribose.
9 Các base tạo nên các nucleotid của DNA là A, G, C, và T. Các base tạo nên nucleotid của RNA là A, G, C và U.
9 Phân tử DNA thông thường được tạo bởi hai chuỗi nucleotid, trong khi đó RNA thông thường chỉ có một chuỗi. Tuy nhiên, có vài trường hợp ngoại lệ RNA của một số virus có hai chuỗi nucleotide.
Ở sinh vật Eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T). Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro, giữa NH2 và CO, N và NH. Do đó, A bổ sung cho T có hai nối hydrogen, G bổ sung cho C có ba nối hydrogen, tỷ lệ giữa A/T=1 và G/C=1. Tuy nhiên, tỷ lệ (A+T)/(G+C) hay thay đổi giữa các DNA khác nhau và đặc trưng cho loài. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’ phosphate tự do và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5’ặ 3’). Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kộp ngược nhau và gọi chỳng là hai mạch đối song song. Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung.
Chính tính chất này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử.
2.7.2. Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp tách triết DNA cơ bản gồm ba bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (Eucaryote). Thông thường, người
ta nghiền tế bào, mô trong hợp chất tẩy (như SDS, sarcosyl) và Proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phá hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là
các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong dung dịch Phenol và Chloroform, dung
dịch Phenol và Chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha Phenol:Chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích tủa là nhằm thu acid nucleic dưới dạng
cô đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác ta có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có hai phương pháp tủa thường dùng :
9 Tủa trong Ethanol (Ethylic alcohol), việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ Ethanol cao (2,5 dung tích Ethanol/1dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa.
9 Tủa trong Isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích Isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có phân tử trọng lượng nhỏ không bị tủa. Do đó, có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong Isopropanol.
Trong hai phương pháp trên có thể thu acid nucleic bằng ly tâm. Sau đó cặn tủa rửa trong Ethanol 70% để loại các muối hoặc Isopropanol còn dính lại trên mẫu.
Một số vấn đề gặp phải khi ly trích DNA 9 Có lẫn tạp RNA trong mẫu.
9 Lẫn tạp chất Polysaccharide trong mẫu DNA.
9 DNA bị đứt gẫy.
2.7.3. Đánh giá chất lượng DNA 2.7.3.1. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích được. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine.
Giá trị mật độ quang (OD: Optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: 1 đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50 àg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kộp và 40 àg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD280nm. Tại bước sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA.
Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 đối với DNA tinh khiết.
Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết.
2.7.3.2. Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của các phân tử này được phân tích trên bảng gel, nó phụ thuộc vào hai yếu tố: khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel. Việc lựa chọn các loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách.
ắ Gel agarose: Là loại gel thụng dụng nhất, dựng để phõn tỏch những đoạn DNA có kích thước từ 0.5 – 200 kb. Dùng điện di phương ngang.
ắ Gel polyacrylamide: Được dựng để phõn tỏch những đoạn cú kớch thước nhỏ, dưới 1000 bp. Dùng điện di phương thẳng đứng.