PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm [9]
Ly tâm thu dịch nổi, kết tủa protein bởi TCA 30%
Ly tâm, kết tủa EPS 2 lần bởi ethanol lạnh, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1:2
Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – acid sunfuric Môi trường
MRS bổ sung 2%
lactose và 1% glucose
MRS bổ sung nồng độ glucose (2%, 3%,
4%, 5%, 6%)
MRS bổ sung nồng độ lactose (2%, 3%, 4%, 5%,
6%)
MRS bổ sung nồng độ
saccharose (2%, 3%, 4%, 5%, 6%)
MRS bổ sung đường
trong nước dừa (25%, 50%, 75%,
100%)
Trong thời gian 12 giờ,
24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,
60 giờ và 72 giờ Ly tâm thu sinh khối, rửa 2 lần trong dd
1% pepton và 0.85% NaCl Nuôi cấy tăng sinh trong MRS broth
(24h, 370C)
Chủng vi khuẩn L. farciminis gốc
Nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau ở 37oC và 420C, 48h
Đưa về OD = 1
Thuyết minh sơ đồ: từ chủng Lactobacillus farciminis gốc ta tiến hành tăng sinh trong ống ependot chứa môi trường MRS borth sau đó tiến hành cấy trang các chủng vi khuẩn L. farciminis (TC25, TC28, TC30) từ các ống tăng sinh lên đĩa MRS agar để thu khuẩn lạc đơn, chọn khuẩn lạc đơn tốt rồi tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC, pH = 6 – 6,2. Sau khi nuôi cấy, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 5000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 10 phút nhằm mục đích thu sinh khối. Loại bỏ môi trường và rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch 1%
pepton và 0,85% NaCl. Sinh khối sau đó được đưa vào môi trường nuôi cấy ở mật độ 106 CFU/ml.
Quá trình nuôi cấy để sinh EPS được thực hiện trong ống fancol có chứa 10ml môi trường MRS nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, thời gian nuôi là 48 giờ với các môi trường khảo sát sau: môi trường MRS bổ sinh 1% glucose và 2%
lactose để chọn chủng vi khuẩn L. farciminis sinh tổng hợp EPS cao, môi trường MRS bổ sung (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng glucose, môi trường MRS bổ sung (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng lactose, môi trường MRS bổ sung (2%, 3%, 4%, 5%, 6%) hàm lượng saccharose, môi trường MRS bổ sung (25%, 50%, 75%, 100%) lượng đường trong nước dừa, sau đó ta chọn môi trường bổ sung đường sinh tổng hợp EPS cao để tiến hành khảo sát trong 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ để biết được thời gian nuôi cấy thích hợp để chủng L.
farciminis sinh tổng hợp EPS cao. Kết thúc thời gian nuôi cấy, dịch nuôi cấy được ly tâm tách sinh khối tế bào ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để thu dịch nổi có chứa EPS.
Dịch nổi có chứa EPS được kết tủa protein bởi 30% TCA, để qua đêm ở nhiệt độ 4oC. Sau đó, dịch nổi được tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để loại bỏ protein.
Sau khi loại bỏ protein dịch có chứa EPS được bổ sung thêm ethanol lạnh 99o để kết tủa EPS, tỷ lệ dịch nổi : ethanol = 1:2, để qua đêm ở 4oC. Tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút, sau đó ta hòa tan tủa bằng nước 500C rồi tiến hành tinh sạch cồn lần 2 với tỉ lệ dịch : etanol là 1:2.
Tiến hành ly tâm ở 5000 vòng/phút, nhiệt độ 4oC trong vòng 10 phút để thu EPS. Sau đó, hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol-sunfuric.
3.2.1. Phương pháp vi sinh
3.2.1.1. Hoạt hóa và giữ giống [4]
Chủng vi khuẩn Lactobacillus farciminic phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống ở huế được giữ giống trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 30%
glycerol và được bảo quản ở nhiệt độ -200C.
3.2.2.2. Phương pháp tăng sinh
Cách tiến hành: từ chủng Lactobacillus farciminis gốc ta tiến hành tăng sinh trong ống eppendoff chứa môi trường MRS borth sau đó tiến hành cấy trang các chủng vi khuẩn L. farciminis (TC25, TC28, TC30) từ các ống tăng sinh lên đĩa peptri chứa MRS agar để thu khuẩn lạc đơn, chọn khuẩn lạc đơn tốt rồi tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC, pH = 6 – 6,2. Sau đó đưa về OD = 1 rồi tiến hành nuôi 48 giờ để sinh EPS.
3.2.2. Phương pháp vật lý
3.2.2.1. Phương pháp đo mật độ quang[52]
Mục đích: định lượng tế bào vi sinh vật.
Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể được xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang.
Cách tiến hành:
Sau khi nuôi 24 giờ, ta tiến hành ly tâm thu sinh khối, rửa 2 lần trong dung dịch 1% pepton và 0.85% NaCl và tái huyền phù. Tiến hành vortex pha loãng rồi cho vào cuvec tiến hành đo OD.
- Khối lượng tế bào được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nm với mẫu trắng (blank) là nước muối sinh lý vô trùng. Mẫu được pha loãng bằng nước muối sinh lý vô trùng.
- Cách pha loãng để đưa về OD = 1.
Số ml cần hỳt = số ml mụi trường nuụi cấyì 10 6/ số OD ì 8 ì 108 3.2.2.2. Phương pháp xác định pH
Xác định pH của môi trường nuôi cấy và mẫu thí nghiệm bằng máy đo pH điện tử.
3.2.2.3. Phương pháp ly tâm
Sử dụng máy ty tâm K241R để tiến hành ly tâm ống fancol lớn với 5000 vòng/phút.
3.2.3. Phương pháp hóa học 3.2.3.1. Kết tủa protein bằng TCA
- Cơ chế: ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton) và khi ta cho TCA vào, các ion mang điện tích âm trichloroacetate sẽ liên kết với các protein tích điện dương làm cho chúng kết dính lại và kết tủa [23],[53].
- Cách tiến hành: Sau khi lên men 48h, ta ly tâm 5000 vòng 10 phút ở 4oC thu được dịch nổi sau đó cho TCA 50% vào.
Lượng TCA cho vào tương ứng 70ml dung dich cần 30ml TCA(100%).
3.2.3.2. Phương pháp kết tủa EPS bằng dung môi (etanol 99o) [33]
Cơ chế: phương pháp kết tủa bằng ethanol (Zheng và cộng sự, 2008) được sử dụng để xác định lượng EPS sản sinh ra bởi vi khuẩn. EPS có thành phần chủ yếu là các polysaccharide (Tsuneda và cộng sự,2003). Ethanol phá vỡ quá trình hydrate hóa của các polysaccharide và các ion tích điện trong nước. Điều này cho phép các phân tử polysaccharide đến gần nhau hơn, tương tác và tạo thành khối ổn định và có thể thu được bằng cách ly tâm.
Cách tiến hành: vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường MRS broth 48 giờ. Ethanol lạnh được cho vào dịch vi khuẩn sau ly tâm (5.000 rpm, 4
oC, 10 phút) với tỷ lệ 2: 1 và giữ lạnh ở 40C trong vòng 24 giờ. Lượng EPS kết tủa được thu bằng cách ly tâm ở 5.000 rpm, 4ºC trong 10 phút.
3.2.3.3. Phương pháp phenol - sulfuric để định lượng EPS tinh khiết [25],[1]
- Nguyên tắc: dựa vào phản ứng thuỷ phân PS thành mono, mono tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490 nm.
- Cách tiến hành:
•Dựng đường chuẩn glucose bằng cách pha các dãy nồng độ glucose 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 μg/ml.
•Mỗi mẫu lấy 1 mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
•Chưng cách thủy 2 phút rồi để nguội, tiến hành đo OD 540 nm.
•Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn glucose với buớc song 490nm. Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch EPS ở bước sóng 490 nm.
Kết hợp với phương trình đường chuẩn, suy ra hàm lượng EPS tinh khiết có chứa trong mỗi mẫu EPS tổng thô.
3.2.3.4. Phân tích hàm lượng nước dừa bằng DNS [47]
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nước dừa.
3.2.5. Phương pháp toán học
- Xử lý bằng phần mềm SPSS 20 để hệ thống hóa các số liệu nghiên cứu.
PHẦN 4