KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. Kết quả khảo sát điều kiện môi trường thích hợp để chủng vi khuẩn L
farciminis TC30 đã được tuyển chọn sinh EPS cao
Đối với mỗi loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng phụ thuộc rất lớn vào điều kiện môi trường như thời gian nuôi cấy,
pH, nhu cầu dinh dưỡng,… Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…,[49].
4.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nguồn cacbon để chủng vi khuẩn L. farciminis TC30 sinh EPS cao
Nguồn cacbon là nguồn vật chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Cacbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào.
Đồng thời hầu hết các nguồn cabon trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn cacbon duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn cacbon không phải là nguồn sinh năng lượng.
Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn cacbon. Đường nói chung là nguồn cacbon và là nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật. Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ trong môi trường chứa glucose và galactose thì vi khuẩn Escherichia coli sử dụng glucose trước (gọi là nguồn cacbon tốc hiệu) còn galactose được sử dụng sau (gọi là nguồn cacbon trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn cacbon chủ yếu là glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose.
Năng lực đồng hoá các nguồn cacbon ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới trên 90 loại hợp chất cacbon, nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1cacbon như methanol, methane...[2].
4.2.1.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose khác nhau trong môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng glucose bổ sung trong môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. farciminis TC30 đã tuyển chọn, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như (bảng 4.1) . Môi trường MRS được bổ sung thêm đường glucose với các tỷ lệ khác nhau và được bố trí
thành năm môi trường nuôi cấy MT1, MT2, MT3, MT4, MT5 và một môi trường đối chứng (ĐC).
Bảng 4.1. Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đường glucose của chủng L. farciminis TC30
Ký hiệu Môi trường nuôi cấy
ĐC MRS borth
MT1 Bổ sung 2% glucose vào môi trường MRS borth MT2 Bổ sung 3% glucose vào môi trường MRS borth MT3 Bổ sung 4% glucose vào môi trường MRS borth MT4 Bổ sung 5% glucose vào môi trường MRS borth MT5 Bổ sung 6% glucose vào môi trường MRS borth
Sau khi nuôi cấy và thu nhận, hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol – sunfuric. Kết quả được thể hiện ở hình 4.3 (xem thêm phụ lục 5.2).
Hình 4.3. Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L.
farciminis TC30
Từ hình 4.3 ta có thể nhận thấy rằng hàm lượng EPS khi bổ sung thêm đường glucose với các tỉ lệ khác nhau có sư giao động tương đối lớn từ 86,458 – 200,000 àg/ mL. Thấp nhất là mụi trường MRS borth (ĐC) với hàm lượng EPS đạt được 86,458e àg/ mL, tiếp đến là mụi trường MRS borth bổ sung 2% glucose (MT2) với lượng EPS là 149,208d àg/ml, mụi trường MRS borth bổ sung 3%
glucose (MT3) với lượng EPS là 168,083c àg/ml, mụi trường MRS borth bổ sung 6% glucose (MT6) với lượng EPS là 173,000bc àg/ml, mụi trường MRS borth bổ sung 4% glucose (MT4) với lượng EPS là 175,250b àg/ml và cao nhất là môi trường MRS borth bổ sung 5% glucose (MT5) với hàm lượng EPS đạt được 200,000a àg/ mL. Qua đú ta thấykhả năng sinh EPS cú xu hướng tăng dần khi ta bổ sung lượng glucose càng lớn. Tuy nhiên ở môi trường MRS bổ sung 6% có xu hướng giảm cho thấy ở nồng độ này đã xuất hiện sự ức chế sự phát triển của vi khuẩn dẫn đến sinh tổng hợp EPS giảm dần. Kết quả so màu cho thấy hàm lượng EPS càng cao thì màu sắc thể hiện càng đậm, hàm lượng EPS càng thấp thì màu sắc thể hiện càng nhạt như ở (phụ lục 2.1). Điều này cũng tương tự như kết quả của một số tác giả khác khi nồng độ glucose tăng thì hàm lượng EPS tăng ở nồng độ nhất định.
Fukuda K và cộng sự (2014), tiến hành nghiên cứu Lactobacillus fermentum TDS030603 cho thấy khi nuôi cấy vào 10 ml môi trường MRS và ủ tĩnh trong 24 giờ ở 30°C. Các tế bào sinh khối được phân tách bằng cách ly tâm ở 12000 vòng trong 5 phút và rửa sạch với nước muối phosphate buffered (PBS) 3 lần. Tiến hành đo với bước sóng 600 nm, sau đó nuôi trong môi trường có bổ sung 1%, 5% glucose thì kết quả đạt được khi glucose 5% đã được thêm vào như là một bổ sung thì hàm lượng EPS sản xuất (183,7 ± 24 mg/l) là cao hơn đáng kể hơn so với 1% (113 ± 22 mg/l) [37].
Một nghiên cứu khác của tác giả Fang Zhong (2002) và Papagianni et al., (1999) về chủng Aspergillus niger và G. lucidum cho biết khi bổ sung vào môi trường với nồng độ glucose 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l thì hàm lượng EPS tăng dần đến nồng độ 40g/l glucose là cao nhất với hàm lượng đạt được là 0.89 g/l và thấp nhất ở nồng độ 20 g/l glucose với hàm lượng EPS đạt được là 0,40g/l, kết quả cho thấy nồng độ glucose ban đầu 40 g / l là tối ưu cho sản xuất EPS [13]. Từ đó ta có thể thấy rằng chủng L. farciminis với việc bố sung nguồn cacbon là glucose thì khả năng sinh EPS của chúng là tương đối cao và thích hợp nhất ở nồng độ bổ sung vào 50g/l glucose vào môi trường.
Năm 2012, Baojing Yuan, Xiaoyan Chi, Rijun Zhang đã tiến hành nghiên cứu tám nồng độ glucose khác nhau (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, và 80 g/l) được sử dụng như là nguồn carbon bổ sung để sản xuất EPS và tăng trưởng sợi nấm của G. lucidum CAU5501. Kết quả thu được hàm lượng EPS thu được khi bổ sung 60 g/l glucose đạt hàm lượng cao nhất với 0.9 g/l, thấp nhất ở nồng độ glucose 20 g/l với hàm lượng là 0,4 g/l EPS, và có xu hướng tăng dần khi bổ sung từ nồng độ 20 – 60 g/l glucose, sau đó có sự giảm mạnh ở nồng độ 70g/l glucose với hàm lương EPS đạt được là 0,5 g/l [44].
Năm 1994, Cerning và cộng đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon đến sản xuất EPS của chủng vi khuẩn L. casei CG11 và phân tích cấu trúc polymer. Kết quả cho thấy rằng cả sản lượng và các thành phần của EPS sản xuất bởi L. casei CG11 phụ thuộc vào nguồn carbon hiện tại trong môi trường.
Glucose là nguồn carbon có hiệu quả nhất cho sản xuất EPS, trong khi lactose không phải là một nguồn carbon hiệu quả. Sản xuất EPS tối đa khi bổ sung 20 g/l glucose vào môi trường là 160 mg/l và thấp nhất khi bổ sung 2 g/l glucose môi trường là 70 mg/l [42].
Lam JH và Lee YK đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glucose vào sản xuất EPS của Lactobacillus casei trong môi trường MRS được bổ sung nồng độ glucose 3, 15, 30, 50, 80, 100 và 120 g/l sau đó được nuôi ở 370C rồi tiến hành kết tủa 10% TCA và tách chiếc EPS bằng etanol 95%. Kết quả củng đã được tác giả công bố khi bổ sung các nồng độ đường tăng dần thì hàm lượng EPS cũng tăng theo với hàm lượng lớn nhất là ở môi trường MRS bổ sung 120 g/l glucose với hàm lương EPS là 0,466 mg/ml. thấp nhất là ở môi trường MRS bổ sung 3 g/l glucose với hàm lượng là 0,245 mg/ml [27].
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nguồn carbon vào sản xuất EPS của chủng Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus B3, G12 và W22 của Zehra Nur Yuksekdag và Belma Aslim khi glucose được bổ sung vào MRS và M17 phương tiện truyền thông ở nồng độ 5, 10, 15, 20, 25, 30 g/l và được nuôi ở 420C trong 18h, sau đó loại bỏ các tế bào và protein đã được thực hiện bằng cách ly tâm. EPS được kết tủa với ethanol (100% v / v). Nó đã được phục hồi bằng cách ly tâm ở 4 ºC tại 14000 rpm trong 20 phút. Tổng số EPS (thể hiện như mg/l) được ước tính trong mỗi mẫu theo phương pháp phenol – sulfuric (Dubois et al., 1956) sử dụng glucose làm chuẩn (Torino et al., 2001). Kết quả cho thấy ở nồng độ 30 g/l bổ sung vào cho hàm lượng EPS cao nhất với hàm lương tương ứng của chủng B3, G12 và W22 là 224 mg/l, 255 mg/l, 174 mg/l [45].
4.2.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30
Lactose là loại đường sữa được sử dụng phổ biến hiện nay, do trong cấu trúc của EPS có các đơn vi monosaccharides D-glucose, D-galactose, trong đó có D-glucose, D-galactose là kết quả của sự thủy phân đường lactose. Nên chúng tôi chọn lactose để bổ sung vào môi trường MRS borth nhằm để tăng khối lượng EPS.
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lactose bổ sung trong môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. farciminis TC30 đã tuyển chọn, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như bảng (3.3). Môi trường MRS được bổ sung thêm đường lactose với các tỷ lệ khác nhau và được bố trí thành năm môi trường nuôi cấy MT6, MT7, MT8, MT9, MT10 và một môi trường đối chứng (ĐC).
Bảng 4.2. Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đường lactose của chủng L. farciminis TC30
Ký hiệu Môi trường nuôi cấy
ĐC MRS borth
MT6 Bổ sung 2% lactose vào môi trường MRS borth MT7 Bổ sung 3% lactose vào môi trường MRS borth MT8 Bổ sung 4% lactose vào môi trường MRS borth MT9 Bổ sung 5% lactose vào môi trường MRS borth MT10 Bổ sung 6% lactose vào môi trường MRS borth
Sau khi ly tâm thu tủa tiến hành nuôi trong môi trường MRS borth có bổ sung thêm các nồng độ đường lactose, tách chiếc rồi xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sunfuric thì kết quả được thể hiện trên hình 4.4 (xem thêm phụ lục 5.3).
Hình 4.4. Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lactose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L.
farciminis TC30
Nhìn chung sau khi bổ sung lactose với các tỉ lệ khác nhau vào MRS borth ta thấy rằng tất cả các môi trường đều có khả năng sinh tổng hợp EPS trong đó hàm lượng EPS có bổ sung đường lactose cao hơn nhiều so với môi trường ĐC khụng bổ sung lactose, nú dao động trong khoảng 81,833 – 214,792 àg/ml EPS.
Cao nhất là môi trường MRS bổ sung 5% lactose (MT9) với hàm lương EPS đạt được 214,792a àg/ml cao gần gấp 3 lần mụi trường ĐC với hàm lượng EPS đạt được là 81,833f àg/ml, lớn hơn 97,542 àg/ml so với mụi trường MRS bổ sung 2% lactose (MT6) với hàm lương EPS đạt được 117,250e àg/ml, lớn hơn 61,909 àg/ml so với mụi trường MRS bổ sung 3% lactose (MT7) với hàm lương EPS đạt được 152,833d àg/ml, lớn hơn 49,625 àg/ml so với mụi trường MRS bổ sung 4% lactose (MT8) với hàm lương EPS đạt được 170,042c àg/ml và lớn hơn 18,25 àg/ml so với mụi trường MRS bổ sung 6% lactose (MT10) với hàm lương EPS đạt được 195,708b àg/ml.
Nhìn vào biểu đồ ta thấy hàm lượng EPS tăng dần khi ta bổ sung dần 2%, 3%, 4% , 5% lượng đường lactose nhưng ở tỉ lệ 6% lượng đường lactose bổ sung vào ta thấy, hàm lượng EPS có xu hướng giảm, đều này có thể nói lên ở môi trường bổ sung 6% lượng đường lactose đã có sự ức chế đến sự sinh trưởng của vi khuẩn dẫn đến quá trình sinh tổng hợp EPS thấp.
Kết quả so màu cho thấy hàm lượng EPS càng cao thì màu sắc thể hiện càng đậm, hàm lượng EPS càng thấp thì màu sắc thể hiện càng nhạt như ở (phụ lục 2.2). Điều này cũng tương tự như kết quả của một số tác giả khác khi nồng độ lactose tăng thì hàm lượng EPS tăng ở nồng độ nhất định.
Năm 2000 Van Den Bogaard và cộng sự cho thấy, Streptococcus thermophilus là một vi khuẩn lactic đánh giá cao thích nghi với sự phát triển trên lactose như carbon chính và nguồn năng lượng. Đồng thời tác giả cho thấy việc bổ sung đường lactose cho hàm lượng EPS cao hơn đường glucose, fructose và galactose, cụ thể việc bổ sung lactose cho hàm lượng EPS lượng cao hơn so với các mẫu với fructose có 36,1%. Ngoài ra, cao hơn 20,7% so với mẫu có galactose và cao hơn so với mẫu có glucose 16,3%. Bên cạh đó tác giả còn cho thấy với việc bổ sung đường lactose tăng dần thì hàm lượng EPS cũng tăng lên khi ta bổ sung 1% lactose lên 4% lactose thì hàm lượng EPS đạt được 64,78 mg/l – 67,71 mg/l [43].
Năm 2006, Chiu-Yeh WU, Zeng-Chin Liang, Chian-Ping Lu và Shiu- Hsiung WU đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ vào sản của EPS bởi chủng Pleurotus citrinopileatu. Chủng được nuôi trong môi trường
MRS bổ sung thêm 2%, 3%, 4%, 5% đường saccharose. Mẫu được ly tâm ở 3000 rpm trong 20 phút, và kết tủa bằng 2 lần ethanol 95% , khuấy mạnh mẽ qua đêm ở 4°C. Kết tủa thu được làm kết phục hồi bằng cách ly tâm (Model CN- 6000, Hsiang Tai Máy móc Ind. Co., Ltd., Đài Bắc, Đài Loan,) 3000 rpm trong 20 phút, rửa sạch hai lần với 75% ethanol. Tác giả đã công bố ảnh hưởng của một số nguồn carbon lên sinh khối sợi nấm và EPS được sản xuất bởi P.
citrinopileatus với 2,5% men peptone điện như nguồn nitơ sau khi ủ 14 ngày như sau. Hàm lượng EPS tương ứng với hàm lượng đường bổ sung 2%, 3%, 4%, 5% lần lượt là 1,46 g/l, 1,42 g/l, 1,46 g/l, 1,48 g/l [11].
Ở nghiên cứu này tác giả đã tiến này nuôi trong môi trường chứa 8,9 g peptone, 5 g nấm men và 1 lít nước biển nhân tạo ở pH 8,0. Sản xuất EPS đã được nghiên cứu trong môi trường có bổ sung các nguồn carbon khác nhau, kể cả đường lactoza, glucose, galactose và cũng như sự kết hợp của glucose với một trong hai đường lactose hoặc galactose. Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy rằng lactose tăng đáng kể sản xuất EPS trong SM-A87 so với galactose và sự kết hợp của một trong hai glucose và lactose hoặc glucose và galactose.
Khi lactose là nguồn carbon, sản xuất EPS là 6,6 g/l. Trong các trường hợp khác, việc sản xuất EPS là ít hơn 2,0 g/l. Khi môi chứa lactose và glucose đồng thời, việc sản xuất EPS cũng thấp (1,6 g/l), trong đó chỉ ra rằng glucose có thể ức chế tác dụng tăng cường lactose vào sản xuất EPS trong SM-A87 [34].
Từ những kết qủa nghiên cứu trên ta thấy việc bổ sung lượng đường lactose cho quá trình tổng hợp sinh EPS là cần thiết trong quá trình nghiên cứu các điều kiện môi trường sau này và thu lượng sinh khối lớn để phân tích cấu trúc EPS.
4.2.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccharose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng Lactobacillus farciminis TC30
Sacharose là loại đường mía được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, khi thủy phân saccharose tạo thành glucose và fructose trong đó glucose là loại đường rất cần thiết cho quá trinh sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic, mặt khác đường saccharose dể tìm kiếm và giá thành rẽ nên tôi quyết định chọn saccharose để khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh tổng hợp EPS.
Để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng saccarose bổ sung trong môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. farciminis TC30 đã tuyển chọn, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như bảng 4.3. Môi trường MRS được bổ sung thêm đường saccharose với các tỷ lệ khác nhau và được bố
trí thành năm môi trường nuôi cấy MT6, MT7, MT8, MT9. MT10 và một môi trường đối chứng (ĐC)
Bảng 4.3. Bảng môi trường MRS borth bổ sung tỉ lệ phần trăm đường saccharose của chủng L. farciminis TC30
Ký hiệu Môi trường nuôi cấy
ĐC MRS borth
MT11 Bổ sung 2% saccharose trong MRS borth MT12 Bổ sung 3% saccharose trong MRS borth MT13 Bổ sung 4% saccharose trong MRS borth MT14 Bổ sung 5% saccharose trong MRS borth MT15 Bổ sung 6% saccharose trong MRS borth
Sau khi ly tâm thu tủa tiến hành nuôi trong môi trường MRS borth có bổ sung thêm các nồng độ đường saccharose khác nhau, tách chiếc rồi xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol – sunfuric thì kết quả được thể hiện trên hình 4.5 (xem thêm phụ lục 5.4).
Hình 4.5. Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose bổ sung vào môi trường MRS borth đến khả năng sinh tổng hợp EPS
bởi chủng L. farciminis TC30
Qua đồ thị hình 4.5, nhận thấy chủng L. farciminis TC30 đều có khả năng sinh tổng hợp EPS trên tất cả 5 môi trường bổ sung bằng saccharose vào MRS