4.2.1. Khảo sát dung môi ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Để đánh giá hiệu quả của dung môi trích ly, chúng tôi đã sử dụng phương pháp đo mật độ quang UV-VIS nhằm chọn lựa dung môi tối ưu. Chúng tôi khảo sát đo bước sóng là 370nm đối với ethyl acetace và ethanol, nước cất [33].
Trong quá trình trích ly quercetin, dung môi là yếu tố thứ 4 ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly sau loại nguyên liệu, nhiệt độ sấy và phương pháp sấy. Mỗi loại dung môi khác nhau sẽ có khả năng trích ly khác nhau. Vì vậy, việc khảo sát loại dung môi trích ly là quá trình quan trọng nhằm đưa ra loại dung môi thích
hợp để góp phần nâng cao hiệu quả trích ly quercetin từ lá non chùm ngây.
Thông thường, yêu cầu dung môi phải hòa tan tốt các cấu tử cần chiết, nếu cấu tử cần chiết có cấu tạo phân cực thì phải chọn dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol, ethylacetat. Ngược lại, nếu cấu tử cần chiết không phân cực thì phải lựa chọn dung môi không phân cực như benzen, n- hexan, ete dầu hỏa.
Tham khảo các nghiên cứu trước đây, cho thấy hợp chất quercetin là hợp chất hữu cơ phân cực [41], [44], nên chúng tôi tiến hành chiết tách quercetin từ lá chùm ngây trong dung môi hữu cơ phân cực như nước, ethanol, ethyl acetat. Để khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly quercetin, chúng tôi sử dụng 3 loại dung môi: ethyl acetat, ethanol, nước cất là 3 hóa chất có độ phân cực tăng dần làm dung môi để tách chiết quercetin trong lá chùm ngây.
Để tiến hành khảo sát, đầu tiên với nguyên liệu ta tiến hành tách cuống, loại bỏ lá vàng héo úa, sâu bệnh rồi sấy ở nhiệt độ 500C, trong 3 giờ sau đó cân 5g mẫu đã khô có độ ẩm 7,5% cho vào bình tam giác, cho các dung môi vào lần lượt các bình tam giác đã bỏ mẫu với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:10 bọc giấy thiếc kín trên miệng bình tam giác, cho mẫu vào chưng ninh ở nhiệt độ 500C trong thời gian 3 giờ. Sau khi tách chiết xong thì tiến hành đưa đi lọc để thu dịch chiết (hình 4.3), sau đó đem đi pha loãng để đo OD370nm và chọn ra dung môi tối ưu. Chúng tôi tiến hành với 3 lần lặp lại.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở biểu đồ hình 4.2.
Hình 4.2. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào dung môi tách chiết
(a, b, c: các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=5%)
Từ kết quả ở biểu đồ hình 4.2 chúng tôi nhận thấy:
Dung môi có ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly quercetin. Khi chiết với các loại dung môi khác nhau thì hàm lượng quercetin thu được cũng hoàn toàn khác nhau. Từ kết quả thu được, hàm lượng quercetin đạt thấp nhất (1,746) đối với dung môi nước cất và cao nhất đối với dung môi ethanol (2,026) sau 3 giờ. Sự khác nhau về hiệu quả chiết của dung môi có thể được giải thích như sau: hiệu quả chiết của dung môi phụ thuộc vào khả năng khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu. Dung môi trích ly ảnh hưởng đến độ hòa tan của các hợp chất. Thường các chất phân cực tan tốt trong dung môi phân cực nhờ tương tác lưỡng cực-lưỡng cực giữa các phần tử dung môi và các hợp chất.
Nhưng do quercetin rất ít tan trong nước nên dung môi nước phân cực mạnh nhưng giá trị OD370nm lại thấp nhất (1,746). Trong cùng một điều kiện thì ethanol 70% cho kết quả tách chiết các hợp chất quercein tốt nhất. Mặt khác, quercetin chủ yếu dùng trong y học để chữa bệnh mà ethanol là dung môi không gây độc nên an toàn sức khỏe con người, dễ kiếm, rẻ tiền.
Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi quyết định lựa chọn ethanol làm dung môi để tách chiết quercetin và sử dụng dung môi này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự với nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cộng sự đã sử dụng ethanol để tách chiết quercetin [16].
Hình 4.3. Dịch chiết thu được khi khảo sát 3 dung môi tách chiết nước cất (1), ethanol (2), ethyl acetat (3)
4.2.2. Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (R/L) ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng quercetin thu được sau quá trình trích ly. Tỉ
2 3
1
lệ nguyên liệu:dung môi trích ly tùy thuộc vào đặc tính hòa tan quercetin của từng loại dung môi. Tỉ lệ này phù hợp sẽ xúc tiến nhanh quá trình trích ly, tách kiệt quercetin trong nguyên liệu, giảm thấp hàm lượng quercetin trong bã. Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi lên hiệu quả trích ly là cần thiết.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (R/L) như sau:
1:4 (M1), 1:5 (M2), 1:10 (M3), 1:15 (M4) tương ứng với lượng dung môi là ( 20, 25 , 50 và 75ml) với dung môi chiết là ethanol, thời gian 3 giờ ở nhiệt độ 500C chưng ninh bằng thiết bị Water Bath của hãng Memmert để thu nhận hàm lượng quercetin trong nguyên liệu.
Giá trị quang phổ hấp thu (OD370nm) được biểu diễn ở biểu đồ hình 4.4.
Hình 4.4. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào tỷ lệ R/L (a, b: các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=5%)
Kết quả trên hình 4.4 cho thấy: tỉ lệ nguyên liệu:dung môi ảnh hưởng lớn đến hiệu quả trích ly quercetin. Điều đó thể hiện cụ thể thông qua sự thay đổi giá trị OD370nm ở các tỉ lệ khác nhau. Khi tăng lượng dung môi thì giá trị OD370nm
cũng tăng lên. Tuy nhiên, giá trị này chỉ tăng đến một giới hạn nhất định.
Ở tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:4 thì giá trị OD370nm thấp, chỉ đạt 1,889.
Từ kết quả thu được, giá trị mật độ quang theo tỷ lệ R/L được sắp xếp theo thứ
tự tăng dần, từ tỷ lệ 1:4, 1:5, 1:10, 1:15. Khi tăng tỉ lệ lên 1:5 thì giá trị OD370nm
tăng mạnh lên 2,019 sau đó tăng tỉ lệ nguyên liệu:dung môi đến và 1:10, 1:15 thì mật độ quang cũng tăng lên là 2,026 và 2,046 nhưng sự tăng này là rất ít.
Điều này chứng tỏ, hợp chất quercetin được trích ly từ nguyên liệu lá chùm ngây về mặt định tính tồn tại nhiều hơn khi lượng dung môi chiết tăng lên. Tuy nhiên, về mặt thống kê, sự sai khác về giá trị mật độ quang là không có ý nghĩa.
Kết quả này có thể được giải thích như sau: khi thay đổi tỉ lệ từ 1:4 đến 1:15 về mặt định tính thì hàm lượng quercetin thu được đều tăng. Như vậy, tùy thuộc vào tỉ lệ nguyên liệu:dung môi khác nhau mà hiệu quả chiết quercetin sẽ khác nhau. Khi sử dụng tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cao đồng nghĩa với lượng dung môi sử dụng lớn, sẽ giúp hòa tan triệt để lượng quercetin có trong nguyên liệu làm cho hiệu quả chiết cao. Ngược lại, khi sử dụng tỉ lệ này nhỏ sẽ không đủ dung môi hòa tan hết được lượng quercetin có trong nguyên liệu nên hiệu quả chiết thấp. Tuy nhiên, khi đã đạt đến mức độ chiết cao nhất nếu vẫn tiếp tục tăng thể tích dung môi sẽ không mang lại hiệu quả vì lúc đó một số tạp chất cũng bị chiết theo và gây lãng phí dung môi. Kết quả thí nghiệm khảo sát nêu trên, với tỉ lệ dung môi 1:15 là cao nhất nhưng không sai khác so với tỉ lệ 1:5 nên chúng tôi chọn tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5(g/ml).
So sánh với kết quả [45], thì tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (g/ml) có sự sai khác, sự sai khác này có thể là do nguyên liệu khác nhau dẫn đến sự sai khác về thành phần trong nguyên liệu. Vì vậy, tỷ lệ R/L để tách chiết cũng có sự khác nhau.
4.2.3. Khảo sát mức năng lượng của phương pháp Microwave (lò vi sóng) ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp tách chiết, thông thường các phương pháp đơn giản, dễ thực hiện là sự lựa chọn hàng đầu. Với trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm ngoài việc khảo sát tách chiết bằng phương pháp chưng ninh chúng tôi còn sử dụng phương pháp lò vi sóng. Với những tính năng vượt trội mà nó có được, vi sóng được ứng dụng rộng rãi và tin cậy. Đặc biệt trong các phản ứng cần cấp nhiệt, vi sóng còn có tác dụng tăng cường khuấy trộn, tăng tiếp xúc pha làm cho hiệu suất phản ứng được lớn lên.
Vi sóng đã được ứng dụng trong các lĩnh vực: hỗ trợ chiết xuất, tổng hợp hữu cơ, giảm thời gian phản ứng, tăng hiệu suất [55]. Xuất phát từ những lợi ích như vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết bằng lò vi sóng (phụ lục 6, hình 6.4) để tiến hành khảo sát quá trình chiết tách. Phương pháp lò vi sóng được đặc trưng bởi 2 yếu tố: mức năng lượng và thời gian. Để hiểu rừ hơn về ảnh hưởng của 2 yếu tố này tới quá trình chiết tách quercetin từ lá chùm ngây, chúng tôi bố trí thí nghiệm theo sơ đồ hình 3.4, 3.5.
Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở biểu đồ hình 4.5 dưới đây:
Hình 4.5. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào mức năng lượng
(a, b, c: các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=5%)
Kết quả biểu đồ hình 4.5 cho thấy: mức năng lượng bức xạ ảnh hưởng đến khả năng tách chiết quercetin từ lá chùm ngây. Khi tiến hành chiết tách với các mức năng lượng khác nhau thì giá trị mật độ quang thu được là khác nhau. Điều này được thể hiện cụ thể như sau. Khi tăng mức năng lượng bức xạ từ 90 W lên 180 W thì giá trị OD370nm tăng mạnh từ 0,429 lên 0,739. Tuy nhiên, tiếp tục tăng mức năng lượng lên 360 W và 600 W thì giá trị OD370nm lại giảm xuống 0,586 và 0,333. Điều này chứng tỏ về mặt định tính, khi giá trị mật độ quang càng cao thì hàm lượng quercetin được tách chiết ra càng lớn.
Kết quả này có thể được giải thích như sau: ở giai đoạn đầu đang là giai đoạn gia nhiệt các phân tử trong hỗn hợp nhanh chóng nóng lên và gây ra sự xáo trộn ma sát dẫn đến nguyên liệu và dung môi có cơ hội tiếp xúc mạnh mẽ làm cho giá trị mật độ quang tăng lên và đạt cao nhất là 0,739 tại 180 W.
Ngược lại, khi năng lượng bức xạ tăng thì hiệu suất chiết cũng giảm xuống.
Nguyên nhân có thể là do: khi vượt qua ngưỡng bão hòa thì các chất trong nguyên liệu sẽ không tan vào trong dung môi được nữa. Mặt khác, mức năng lượng tương tự như nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết
quercetin. Khi năng lượng hay nhiệt độ quá cao dẫn đến sự suy thoái hợp chất quercetin [28].
Vì vậy, chúng tôi chọn mức năng lượng 180 W để tiến hành khảo sát thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Khảo sát thời gian của phương pháp Microwave (lò vi sóng) ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Sau khi tiến hành khảo sát mức năng lượng của phương pháp chiết lò vi sóng. Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian chiết của phương pháp Microwave.
Cân 5g mẫu bột lá khô với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5 đưa đi tách chiết tách bằng Microwave ở mức năng lượng 180 W để tiến hành thí nghiệm.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian 10, 20, 30, 40, 50 giây để biết ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hiệu quả trích ly.
Kết quả thu được thể hiện ở biểu đồ hình 4.6.
Hình 4.6. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào thời gian
(a, b, c: các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=5%)
Kết quả cho thấy: nhìn chung, hàm lượng quercetin tăng theo thời gian xử lý vi sóng, từ OD370nm = 0,476 lên 0,739; 1,022 và đạt cao nhất là 1,123 tương ứng với thời gian là 10, 20, 30 và 40 giây. Giá trị mật độ quang khi tách chiết
quercetin từ lá nguyên liệu thể hiện qua giá trị OD370nm. Khi trích ly quercetin bằng lò vi sóng, hàm lượng quercetin cao nhất ở công suất 180 W thời gian 40 giây với giá trị OD370nm là 1,123 cho đến 50 giây thì mẫu bị khô (hình 4.7).
Nguyên nhân có thể là do: dưới tác dụng của vi sóng, nước trong tế bào nóng lên, áp suất bên trong gia tăng nhanh chóng, làm cho các tế bào bị vỡ ra, kết quả là quercetin chứa trong các tế bào lá được giải phóng ra ngoài. Tuy nhiên, ở công suất cao, khi tiếp tục chiếu vi sóng nữa thì vận tốc bốc hơi lớn nên cồn bốc hơi bị thoát ra ngoài. Mặt khác, nếu kéo dài thời gian trích ly có thể dẫn đến những điều không mong muốn xảy ra.
Do đó, chúng tôi chọn thời gian trích ly tối ưu là 30 giây với năng lượng bức xạ là 180 W.
Hình 4.7. Mẫu hỗn hợp nguyên liệu và ethanol trích ly ở 50 giây
4.2.5. Khảo sát nhiệt độ của phương pháp chưng ninh ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Trong quá trình tách chiết một nhân tố khác ảnh hưởng đến khả năng tách chiết là nhiệt độ. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau sẽ có khả năng trích ly quercetin khác nhau. Do đó, việc khảo sát loại dung môi trích ly là quá trình quan trọng nhằm đưa ra nhiệt độ thích hợp để góp phần nâng cao hiệu quả trích ly quercetin từ lá non chùm ngây.
Thông thường, khi tăng nhiệt độ thì khả năng tách chiết cũng tăng lên. Tuy nhiên, ở một mức nào đó thì yếu tố này sẽ gây ra những phản ứng không mong muốn. Vì vậy, nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn. Nếu nhiệt độ trích ly quá thấp thì không đủ nhiệt để hòa tan các hợp chất cần chiết tách làm giảm hiệu quả trích ly. Nếu nhiệt độ quá cao làm tăng các phản ứng hóa học, gây ra những biến tính không có lợi cho hợp chất cần trích ly. Hơn nữa, trong quá trình tách chiết
quercetin muốn tối ưu được các điều kiện tách chiết để có hàm lượng quercetin trong dịch chiết được tách ra là cao nhất. Vì vậy, lựa chọn một nhiệt độ trích ly thích hợp có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình tách chiết.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ hình 3.6 phần trên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dung môi ethanol với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5 (g/ml) trong thời gian 3 giờ bằng phương pháp chưng ninh tiến hành khảo sát ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 500C, 600C, 700C, 800C.
Kết quả được biểu diễn trong biểu đồ hình 4.8.
Hình 4.8. Biểu đồ biểu diễn sự phụ thuộc của giá trị mật độ quang vào nhiệt độ (a, b, c: các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê với p=5%)
Nhiệt độ làm ổn định cấu trúc các phân tử, tăng tốc độ khuếch tán, tăng độ nhớt [21]. Qua thực nghiệm, kết quả thu được được biểu diễn ở biểu đồ hình 4.8, chúng tôi thấy: nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khẳ năng trích ly quercein từ lá chùm ngây. Cụ thể là, ở nhiệt độ 500C thì giá trị OD370nm là 2,019 giá trị này tăng lên và đạt giá trị cao nhất (2,316) tại 600C. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ chiết lên 700C thì giá trị OD370nm lại giảm đáng kể từ 2,316 xuống 1,412.
Sau đó, chúng tôi tiếp tục tách chiết quercetin từ lá Moringa ở 800C, kết quả thu được là mẫu hỗn hợp nguyên liệu và dung môi bị khô (hình 4.9).
Điều này có thể được giải thích như sau: việc tăng nhiệt độ làm tăng sự suy
thoái các hợp chất quercetin. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Everaldo Moreira da Costa và cộng sự khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tách đến sự suy thoái của quercetin, khi tăng nhiệt độ trong quá trình tách chiết thì sẽ làm tăng sự phân hủy và sự chuyển đổi sang các dạng đồng phân khác của quercetin trong sản phẩm [28]. Mặt khác, khi nhiệt độ càng cao sự bay hơi của cồn càng mạnh thì dịch chiết sau khi lọc thu được bị giảm và đến 800C thì khô kiệt. Khi nhiệt độ thấp thì hiệu quả tách chiết không cao, nhiệt độ cao dễ xảy ra các phản ứng khác không cần thiết cho quá trình công nghệ. Từ biểu đồ hình 4.8, chúng tôi chọn nhiệt độ 600C có giá trị mật độ quang cao nhất làm nhiệt độ tách chiết quercetin. Kết quả của chúng tôi tương đồng với kết quả của [16].
Hình 4.9. Mẫu hỗn hợp nguyên liệu và ethanol trích ly ở 800C
4.2.6. Khảo sát thời gian của phương pháp chưng ninh ảnh hưởng đến quá trình tách chiết quercetin từ lá chùm ngây
Thời gian là yếu tố rất quan trọng tiếp theo ảnh hưởng đến khả năng tách chiết. Cũng giống như các yếu tố đã nghiên cứu (dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, nhiệt độ), thời gian có sự ảnh hưởng nhất định đến quá trình trích ly nên cần thời gan để chất cần chiết có đủ thời gian để khuếch tán vào dung môi. Tuy nhiên, không nên kéo dài thời gian chiết quá lâu vì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế và có thể làm giảm khả năng tách chiết. Vì vậy, sau khi đã tiến hành khảo sát các yếu tố đã nêu trên, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian là để xác định được khoảng thời gian thích hợp có thể thu được hợp chất quercetin nhiều nhất. Thời gian chiết phụ thuộc vào nguyên liệu, dung môi sử dụng và nhiệt độ chiết. Tham khảo tài liệu [16], để chiết quercetin có trong lá chùm ngây khi sử dụng dung môi ethanol trong 3 giờ. Dựa theo nghiên cứu trên, trong thí nghiệm này các khoảng thời gian chiết được khảo sát từ 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, sử dụng dung môi ethanol, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:5. Tiến hành bố