Virus là nguyên nhân gây hại tới nhiều loại cây trồng trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Hầu hết các bệnh thực vật do virus gây ra cho tới naychƣacó thuốc đặc trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiềunghiêncứutạinướcta.Từnăm1999,PhòngCôngnghệtếbàothựcvật,Viện Công nghệ Sinh học phối hợp với 5 nước trong khu vực ASEANthamg i a vàochươngtrìnhnghiêncứupháttriểncâyđuđủchuyểngenekhángbệnhvi rus đốm vòng (Papaya ringspot virus- PRSV) do tổ chức ISAAA (International Service for Acquisition of Agri-biotech Applications) tài trợ.
TrongkhuônkhổđềtàinhómthựchiệnđãphânlậpđƣợcgeneCPcủamộtsốchủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bộ. Gene CP đã đƣợc sử dụngđểthiết kế các cấu trúc chuyển gene vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gene khángvirusđốmvòng.Mộtsốdòngcâyđuđủchuyểngeneđãbiểuhiệntính
kháng virus sau khi thử nhiễm bệnh nhân tạo [2]. Thời gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gene kháng lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gene kháng virus. Tiếp đó, đề tài cấp nhà nước ”Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gene đa đoạn” (KC.04.03/06-10)đ ã
thiếtkếthànhcông 2 đoạn gene nhân tạo mang đa đoan gene CP , NibvàHC- pro của PRSV và 2 đoạn gene đa đoạn RdRp-CP và RdRp-CP-p20-p23 của virusCitrus tristeza virus(CTV) cũng nhƣ đã thiết kế thành công những cấu trúc RNAi mang các gene đa đoạn này [1]. Phân tích phân tử cho thấy sự có mặt của các cấu trúc RNAi trong nhiều dòng câychuyểngene [4]. Đặc biệt, trongđề tài cấpViệnHLKH &CNViệtNam đƣợctiếnhành trong hainăm
2007-2008: “Nghiên cƣ́u ƣ́ng dụng kỹthuật RNAi trong taọ giống cây trồng chuyển gene kháng bệnh virus” đã tạo đƣợc một số kết quả đặt tiền đề cho nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt. Các kết quả đạt đƣợc cụ thể nhƣ sau:
- PhânlậpđƣợcđoạngeneCPcủamộtsốdòngvirusTMVvàCMVtạimột số tỉnh phíaBắc
- Thiết kế đƣợc một số cấu trúc RNAi mang đoạn gene CP củavirusTMV và CMV đồng thời tạo đƣợc các dòng cây thuốc lá chuyển genemangc ấ u t r ú c này
- Khả năng kháng virus TMV hoặc CMV của 100 dòng cây chuyển gene trên quymônhà lưới đạt tỷ lệ khoảng 75-84% Phân tích ELISAnhữngdòng cây biểu hiện kháng hoàn toàn đều không phát hiện đƣợc sự có mặtcủavirus TMV.
- Tạo đƣợc một số dòng cây kháng đồng thời cả hai virus TMVvàCMV bằng chuyển cấu trúc mang đoạn gene của cả haivirus.
Kinh nghiệm trong đánh giá tính đa dạng di truyền virus, thiết kế cấu trúc RNAi chuyển gene, taọ và phân tích cây thuốc lá chuyển gene đồng thời kiểm tra tính kháng bằng lây nhiễm nhân tạo đƣợc nhóm nghiên cứu học hỏi và phát huy trong đề tài này . Những kết quả nghiên cứu trênlàbằng chứng
quantrọngchƣ́ngtỏtínhhiệuquảcủacôngnghệRNAitrongtạocâythuốclá chuyển gene kháng virus và khả năng làm chủ công nghệ của các nhà khoa học ViệtNam.Tuyvậy,do thời gian thực hiện đề tàicấpViệnHLKH
&CNViệt Nam hạn chế nên những dòng cây chuyển gene tạo đƣợc còn bộc lộmộtsố nhƣợc điểm khó phát triển thành dòng sảnxuất:
- Mới nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm lá trên nền giống K326. Nghiên cứu tạo cây kháng bệnh xoăn ngọn còn bỏ ngỏ. Nghiên cứu tạo câythuốclákhángđồngthờihaibệnhkhảmlávàxoănngọncũngchƣađƣợcđề cập trong nghiên cứu trướcđây.
- Virus có tính đa dạng di truyền cao nên chỉ phân tích gene CP của các dòng TMV phân lập tại một số địa phương phía Bắc chưa đại diệnđƣợccho virus TMV vàTSWVgây bệnh trên cây thuốc lá tại Việt Nam.
Cần thiết phải phân tích bổ sung thêm các gene chính khác của hai virus này nhằm xây dựng bức tranh toàn cảnh về virus gây bệnh khảm lá và xoăn ngọn trên cây thuốc lá ở Việt Nam, đồng thời làm cơ sở nghiên cứu tạo cây chuyển gene có tính khángrộng.
- Các dòng cây chuyển gene tạo ra vẫn còn chứa gene chọn lọc kháng kháng sinh, do vậy khả năng phát triển thành giống sẽ ít thuận lợi hơn nếu nghiên cứu tạo đƣợc những cây chuyển gene không mang gene kháng kháng sinh này.
Chương 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU