Để phục vụ cho tạo cây trồng chuyển gene kháng 4 loại virus TMV, CMV, TYLCV và TSWV, trong nghiên cứu này, một vector chuyển gene RNAi mang cấu trúc TCYS đã đƣợc thiết kế. Hơn thế nữa, giúp cho cây chuyển gene thân thiện với môi trường, giảm thiểu hạn chế về mất cân bằng
hệ vi sinh vật, vector chuyển gene này sẽ mang gene chọn lọc mannose thay thế cho các gene kháng kháng sinh như đã được sử dụng trước đây.
Kết quả sẽ có 2 bước:
- Thiết kế vector RNAi mang gene chọn lọc mannose(pK7M) - Thiết kế vector pK7M mang đa đoạn TCYS
3.2.1. Kết quả thiết kế vector RNAi mang gene chọn lọc bằng đườngmannose
Từ các bước thí nghiệm như sơ đồ hình 2.1 cho thấy đoạn DNAmangcấu trúc kẹp tóc RNAi đƣợc thu từ vector pK7GWIW2(II) sẽ đƣợc chènthaythế đoạn gene gusplus trong vectorpNOV-gusplus.
Kết quả điện di kiểm tra trên gene agarose 1% đƣợc thể hiện trong hình 3.3 cho thấy, sản phẩm cắt từ vector pNOV-gusplus thu đƣợc 2 phânđoạnkích thước khoảng 7000 bp và 3500 bp (Hình 3.3, mẫu số 1). Trong đó,đoạncó kích thước khoảng 7000 bp, tương ứng với kích thước của genemanAmãhoá cho PMI cần quan tâm, đƣợc tinh sạch để tiếp tục làm phản ứng gépnốivới cấu trúc RNAi.
Hình 3.3.Ảnh điện di kết quả thiết kế vector mang cấu trúc RNAi và gene manA1- Sản phẩm cắt từ vector pNOV-gusplus; 2- Sản phẩm cắt từ
vectorpK7GWIWG2(II); 3- Kết quả sản phẩm nối bằng T4 ligase; M1- Thang DNA chuẩn (Fermentas).
Để thiết kế cấu trúc RNAi, một vector pK7GWIW2(II) đã đƣợc cắt bằng enzyme giới hạnSphI. Kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 1% thu đƣợc
chứa đoạn gene có kích thước khoảng 4935 bp (Hình 3.3, mẫu số 2) là đoạn DNA mang cấu trúc RNAi chứa ccdB và intron. Vì enzymeSphIcắt tạo đoạn gene có đầu so le, nên sản phẩm sau khi cắt đƣợc tạo đầu bằng nhờ enzymeT4 DNA polymerase. Đoạn gene tiếp tục đƣợc xử lý bằng enzymeHindIIIđể tạo vị trí gắn tương thích với genemanA.
Đoạn cấu trúc RNAi cắt từ vector pK7GWIW(II) đƣợc ghép nốivớigenemanAnhờ enzymeT4 ligaseđể tạo thành vector chuyểngene pK7M.
Sản phẩm ghép nối đƣợc biến nạp vào vi khuẩnE.ColiDH5 . Kết quảđiệndi kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu PMI-Fi (5’-GCG CTA GCC ATG GAA AAA CTC ATT AAC TCA G-3’) và NOS-Ri (5’-GGA CTA GTGCTAGCGATCTAGTAACATAGATGA-3’)t r ê n gelagarose1%
đã thu được một băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 12000 bp (Hình 3.3, mẫu số 3) tương ứng với kích thước của sản phẩm ghép nối pK7M theo như tính toán trên lý thuyết.
3.2.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gene RNAi mang cấu trúc đa đoạnTCYS chọn lọc bằng đườngmannose.
Kỹ thuật Gateway đƣợc sử dụng rộng rãi để thiết kế cấu trúc RNAidựatrên các phản ứng tái tổ hợp tại những vị trí đặc hiệu của vi khuẩn Lamda. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng với vector đích khác nhau và nối các đoạn DNA trong một trình tự xác định trước,địnhhướng theo khung đọcmở.
KỹthuậtGatewaygồm hailoại phản ứngLR (làphản ứngtáitổhợpgiữa cácvịtríattL vàattR)và BP(là phản ứngtái tổhợp giữa cácvịtríattB vàattP). Trong nghiên cứu này, phản ứngLRđƣợcsử dụngđểchuyểngeneCP củabốnloại virusTMV,CMV, TYLCVvàTSWVcótrong vectorchopENTR/TCYSchứa trìnhtựattLở 2đầuđoạn geneTCYSvàovectortiếp nhận pK7Mcóchứa cácvịtríattRdướisựxúc tác củaenzymeLRClonaseTMII. Kếtquả tạo ramộtvector biểu hiệnmangcấu trúcRNAi(kýhiệulàpK7M/TCYS)với haivịtrí
chèn đoạn TCYS theo chiều sense và antisense đƣợc ngăn cách bởi một đoạn intron, dưới sự điều khiển của promoter 35S (Hình 3.4).
Cấu trúc vector này sau đó đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng enzymecắthạn chếXbaI,HindIII. Kết quả điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.5A) cho thấysảnphẩmcắttạoracácphânđoạnDNAcókíchthướclầnlượtlàkhoảng1543bp,3394bpvà8 116bp,tươngđươngvớikíchthướccủađốichứngâmpK7GWIWG2(II) chứng tỏ đã
chuyển thành công cấu trúc gene đa đoạn
TCYSvàovectorchuyểngene.ĐểkhẳngđịnhchắcchắngeneTCYSđãđƣợcchuyển thành công vào vector, chúng tôi tiếp tục kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi-2/TSWV-Ri-1. Kết quả kiểm tra trên gel agarose1%chosảnphẩmPCRcókíchthước1000bp,đúngbằngkíchthướcđoạn TCYS đã thiết kế.Sản phẩm này tiếp tục đƣợc tinh sạch để sử dụngchothí nghiệm tiếptheo.
Hình 3.4: Sơ đồ cấu trúc vector pK7M/TCYS
LB: Left T-DNA border; T35S: Terminator 35S; attB1, attB2: Các vị trí tái tổ hợp trongphản ứng LR; TCYS: gene đa đoạn; CmR: gene kháng Chloramphenicol; P35S:
Promoter 35S của Cauliflower mosaic virus; PMI: gene chuyển hoá đường mannose thành nguồn cacbon để cây sử dụng được; RB: Right T-DNA border; vị trí cắt của enzyme giới hạn XbaI vàHindIII.
Hình 3.5: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M/TCYS
bằngenzymeXbaI/HindIII (A) và PCR bằng mồi đặc hiệu TMV-Fi-2/TSWV-Ri-1(B).
M: 1 kb DNA ladder (Geneshun); 1-4: mẫu pK7M/TCYS; (): Đối chứng âm vectorpK7GWIWG2(II).
3.2.3. Kết quả tạo dòng A.tumerfaciens mang vector tái tổhợppK7M/TCYSSauk h i t h i ế t k ế t h à n h c ô n g v e c t o r R N A i m a n g g e n e
đ a đ o ạ n T C Y S (pK7M/
TCYS)c h ú n g t ô i t i ế n h à n h b i ế n n ạ p v e c t o r v à o d ò n g v i k h u ẩ nA . tu mefaciensCV58C1bằngphươngphápxungđiệnvànuôitrongtốithờigian48giờ.Kết quảkiểmtrađƣợcthểhiệntrongbảnđiệndiagarose1% hình (Hình 3.6).
Hình 3.6:Ảnhđiệndisảnphẩmcolony-PCR bằngmồiđặchiệuTMV-Fi-2/TSWV-Ri-1
M: 1Kb DNA ladder (Fermentas); 1-10: mẫu sản phẩm colony – PCR pK7M/TCYS; (+):
Đốichứng dương; (-): Đối chứng âm
Hình ảnh điện di 3.6 cho thấy, với 10 khuẩn lạc đƣợc lựa chọn ngẫu để colony – PCR, chúng tôi thu đƣợc các mẫu số 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10 cho kết quả với kích thước 1000 bp, chứng tỏ các dòng khuẩn lạc này đã được biến nạp thành công gene TCYS. Các khuẩn lạc này sau đó đƣợc nhân lên để phục vụ cho thí nghiệm chuyển gene vào cây thuốc lá.
3.3. Kết quả tạo cây chuyển gene mang cấu trúc RNAiTCYS 3.3.1. Kếtquảxácđịnhnồngđộmannosesửdụngchọnlọccâychuyểngene
Để sử dụng hiệu quả chọn lọc mannose của cây thuốc lá chuyển gene, trướctiênphảixácđịnhđượcảnhhưởngcủađườngmannosetớisựpháttriểncủa cây thuốc láin vitrovà chọn ra đƣợc ngƣỡng nồng độ thích hợp sửdụngcho chọn lọc cây chuyển gene. Chúng tôi đã mảnh lá và chồi non của hai dòng thuốc lá K326 và C9-1 để tiến hành thí nghiệm đánhgiá.
Theo phương pháp như đã trình bày trên, các mảnh lá sau khi nuôitốiđượcđặttrựctiếptrênmôitrườngcóchọnlọcmannosevớicácnồngđộkhácnhau
(Bảng 3.1), sau khoảng 4 tuần kết quả đƣợc đánh giá khả năng táisinhvà hình thái mẫucấy.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mannose tới khả năng tái sinh của mảnh láthuốc lá
Môi Trường
Mannose (mg/l)
Số mẫu cấy
Tỷ lệ mảnh lá tái sinh (%)
Hình thái mẫu cấy (Điểm)
M1 0 25 100 5
M2 5 25 48,56 4
M3 10 25 39,23 3
M4 15 25 18,83 2
M5 20 25 3,89 1
M6 30 25 0 0
Ghi chú: Hình thái mẫu cấy: 5 điểm-mảnh lá phát triển bình thường xanh tốt; 4 điểm- mảnh lá phát triển chậm hơn so với đối chứng âm nhưng vẫn tạo chồi; 3 điểm- mảnh lá phát triển so với đối chứng âm và khả năng tạo chồi giảm 1/2; 2 điểm- mảnh lá vẫn xanh nhưng không tạo đa chồi; 1 điểm: mảnh lá hơi ngả vàng và không tạo chồi; 0 điểm- mảnh lá không tạo chồi và vàng dần.
Theo kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, nồng độ mannose có ảnhhưởngtới khả năng tái sinh của cả hai giống thuốc lá. Khi nồng độ mannose trong môitrườngtăngtừ0–30mg/l,tỷlệtáisinhcủamảnhláthuốclágiảmdầntừ100% về 0 (không có khả năng tái sinh). Khi trong môi trường khôngcómannose,cácmảnhlápháttriểnbìnhthườngỞngưỡngnồngđộmannose20mg/l mảnh lá thuốc lá bắt đầu hơi ngả vàng và khả năng tái sinh rất kém (3,89%). Tới ngƣỡng nồng độ mannose 30 mg/l, toàn bộ cỏc mảnh lỏ đềungảvàng rừ rệt và hoàn toàn không có khả năng táisinh.
Thí nghiệm trên đƣợc lặp lại trên mẫu chồi thuốc lá. Chồi tạo thànhtừmảnhlátrênmôitrườngtáisinhkhôngcómannosetiếptụcđượcđưavàomôitrườngchọnlọ cmannoseởnhữngnồngđộkhỏcnhauđểtheodừikhảnăngrarễ của chồi. Kết quả đƣợc thống kê trong bảng3.2.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của mannose tới khả năng ra rễ của chồi thuốc lá
Môi trường Mannose (mg/l)
Số mẫu cấy Tỷ lệ chồi in vitro ra rễ (%)
Hình thái mẫu cấy (điểm)
M1 0 25 100 5
M2 5 25 53,26 4
M3 10 25 40,39 3
M4 15 25 29,83 2
M5 20 25 6,88 1
M6 30 25 0 0
Ghi chú: Hình thái mẫu cấy: 5 điểm-cây phát triển bình thường xanh tốt; 4 điểm- cây pháttriển chậm hơn, chiều dài thân và rễ giảm đi 2/10 so với đối chứng âm; 3 điểm- cây phát triển chậm hơn, chiều dài thân và rễ giảm đi 4/10 so với đối chứng âm; 2 điểm- cây phát triển chậm hơn, chiều dài thân và rễ giảm đi 6/10 so với đối chứng âm; 1 điểm: cây phát triển chậm với chiều dài thân và rễ giảm đi 8/10 so với đối chứng âm, mảnh lá không tạo chồi; 0 điểm- cây phát triển rất chậm và không ra rễ, chiều dài thân giảm đi 9/10 so với đối chứng âm.
Tươngtựnhưtrênmẫulá,nồngđộmannosecũngcóảnhhưởngtớikhảnăng sinh trưởng và phát triển của cây thuốc lá. Kết quả trong bảng 3.2chothấy, ở nồng độ mannose 5 mg/l tỷ lệ chồi ra rễ giảm chỉ còn 53,26% so với mẫu đối chứng. Nồng độ mannose trong môi trường càng cao, tỉ lệ chồi rarễ
càng giảm. Ở ngƣỡng nồng độ mannose 20 mg/l chồi thuốc lá vẫn sống sót tuy nhiên kém phát triển và gần nhƣ không ra rễ, tỷ lệ ra rễ với chồi thuốc lá rất thấp chỉ 6,88%.Tới ngƣỡng nồng độ mannose 30 mg/l, toàn bộ chồiinvitrođều phát triển kém, còi cọc và không ra rễ.
Qua hai thí nghiệm trên, chúng tôi đã xác định đƣợc nồng độ mannose thích hợp sử dụng trong môi trường chọn lọc cây chuyển gene là 30 mg/l.
3.3.2 Kết quả chuyển cấu trúc RNAi TCYS vào giống thuốc lá C9-1 vàK326 thông qua A.tumefaciens
Quy trình chuyển gene vào giống thuốc lá đã đƣợc Topping và cộngsựthiết lập từ năm 1998 [45]. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc cắtthànhnhững mảnh hình vuông có kích thước 1cm2và đặt lên môi trường táisinhGM hai ngày trước khi biến nạp sau đó đƣợc nuôi cộng sinh với dungdịchhuyền phù củaAgrobacteriumtrong 2 ngày và chuyển sang môi trườngGMcóbổsungkhángsinhdiệtkhuẩn.GiốngthuốcláC9-1vàK326,đượcđặtcácmảnh lá trên môi trường GM trước biến nạp cho hiệu quả tái sinh câythấp.Do vậy, các mảnh lá C9-1 và K326 đƣợc cắt ra từ câyin vitrosẽ đƣợcngâmvào dung dịch huyền phùAgrobacterium(OD600=0,7-1) có lắc nhẹ trong 10 phút. Việc cắt các mảnh lá hình vuông đồng thời có lắc nhẹ trong dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thương thực vật và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khảnăngxâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyểngene.
Ngâm 25 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20mldung dịch huyền phù vi khuẩn trong vòng 10 phút (Hình 3.7A) thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. Sauđóđặt vào bình chứa môi trường cảm ứng GM trong hai ngày ( MS, 1mg/lBAP,30 g/l mannose, 8 g/l agar, 400 mg/l cefotacime, pH 5,8) (Hình 3.7B). Việc bổ sung kháng sinh cefotacime nhằm loại bỏ vi khuẩn còn sót lại trên mảnh lá. Sau 2 – 3 tuần nuôi trên môi trường cảm ứng bắt đầu xuất hiện các chồinhỏ,chuyển sang môi trường tạo cụm chồi (MS, 30g/l mannose, 8 g/l agar,400m g / l c e f o t a c i m e , p H 5 , 8 ) ( H ì n h 3 . 7 C , D ) . T i ế p t ụ c n u ô i s a u 3 – 4 t u ầ n , t á c h
chồi đơn chuyển sang môi trường mới để tạo rễ (Hình 3.7E, F). Tiếp tục nuôi in vitro đến khi cây đạt chiều cao 5 – 7 cm, tiến hành ra cây với giá thể 50% bột trấu và 50% cát (Hình 3.7G) chăm sóc tiếp 2 tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm sau đó chuyển ra cây nhà lưới (Hình 3.7H). Kết quả chuyển gene được thể hiện trong bảng 3.3
A" B" C" D"
E" F" G" H"
Hình 3.7: Hình ảnh qua các bước nghiên cứu của thí nghiệm
A. Ngâm mảnh lá trong dịch khuẩn; B. Đồng nuôi cấy trên GM1; C. Mảnh lá sau 10ngày nuôi cấy;D.Mảnhláđặt trênmôitrườngGM2; E. Cụmchồi trên môi trường GM2;F.RarễtrênmôitrườngRM1;G.Câycontrêngiáthể50%trấuvà50%cát;
H. Cây thuốc lá trong nhà lưới
Bảng 3.3: Kết quả của biến nạp cấu trúc RNAi TCYS vào thuốc lá.
Lô thí nghiệm
Mẫu Mẫu tạo
chồi
Chồi tái sinh
Chổi ra rễ trên MT chọn lọc Số lƣợng Tỷ lệ(%)
K326 2x25 50 136 118 86,76
C9-1 2x25 50 81 62 76,54
ĐC* 4x5 20 10 10 100
(* Đối chứng K326 2x5 và C9-1 2x5 mẫu)
Kết quả trong bảng 3.3 chothấy,cảhaigiống thuốcláK326vàC9-1đềucótỷ
lệmẫu tạo chồilà100%trênmôitrườngchọnlọc.Trong
đó,giốngK326thuđƣợc136chồitáisinhvà118chồitrongsốđórarễ,đạt
tỷlệ86,76%.GiốngC9-1cho kết quả thấphơnkhi chỉ thu đƣợc81chồitái sinhvà62chồi trongsố đócho rarễchiếm tỷ lệ 76,54% (Điều nàycó thểlà dothaotácthínghiệm).
3.3.3. Kết quả phân tích cây chuyển gene.
Việc kiểm tra đánh giá cây chuyển gene là khâu cuối cùng và là quan trọng nhất trong nghiên cứu này. Mục đích của nghiên cứu là tạo đƣợccâychuyển gene có khả năng kháng lại nhiều loại virus. Vì vậy, để kiểm tra tính kháng, các dňng thuốc lá chuyển gene sau 2 – 3 tuần nuôi trong nhŕ lướicùngvới giống đối chứng sẽ được lây nhiễm nhân tạo với các virus TMV,CMVtheo phương pháp của Herbers và cộng sự (1996) [22]. Thí nghiệm lâynhiễmđƣợc lặp lại 3 lần nối tiếp nhau, mỗi lần cách 10 ngày. Kết quả thínghiệmđƣợc thống kê trong bảng3.4.
Bảng 3.4:Kết quả lâynhiễmviruscácdòng thuốcláchuyểngeneTCYSởthếhệT0vàWT Lần lây
nhiễm virus TMV và
CMV
Các dòng cây chuyển gene WT
Số câyđ ƣợclâ y nhiễm
Số cây kháng hoàn
toàn
Số cây có biểu
hiện bệnh
Tỷ lệkhá ng(%
)
Tổng số cây
lây nhiễm
Sốcây không biểu hiện bệnh
Số cây có biểu
hiện bệnh
Tỷ lệkhá ng(%
)
K326 1 60 38 22(++) 10 4 6(+++)
2 38 35 3(+) 4 0 4(+++)
3 35 31 4(+) 0 0
Tổng 60 31 29 51,67 10 0 10 0
C9-1 1 40 25 15(++) 10 3 7(+++)
2 25 19 6(+) 3 0 3(+++)
3 19 17 2(+) 0 0
Tổng 40 17 20 42,5 10 0 0
Ghi chú: (+) - Mức độ biểu hiện bệnh nhẹ (++) - Mức độ biểu hiện bệnh trung bình(+++) - Mức độ biểu hiện bệnh nặng
Theo kết quả thống kê ở bảng 3.4 tỷ lệ kháng hoàn toàn của dòng thuốc lá K326 chuyển gene cấu trúc TCYS là 51,67% và của dòng C9-1 chuyển
gene là 42,5%. Những dòng thuốc lá biểu hiện bệnh do nhiễm virus đều còi cọc, lá xoăn và bị khảm (Hình 3.8)
TCYS-K18 WT TCYS-C17
Hình 3.8: Hình ảnh của cây thuốc lá lây nhiễm TMV và CMV sau 30 ngày WT : cây thuốc lá không chuyển gene; TCYS-C17, K18: các dòng thuốc lá C91 và K326
chuyển gene TCYS
Cùng với việc đánh giá khảng năng kháng bệnh, lá của các cây chuyển gene có tính kháng hoàn toàn đƣợc thu lại, tách DNA để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi-2/TSWV-Ri-1, đối chứng dương là plasmid TCYS, và đối chứng âm là sản phẩm PCR của DNA tách chiết từ lá thuốc lá không chuyển gene (Hình 3.9).
Hình3.9:KếtquảPCRkiểmtrasựcómặtcủageneTCYStrongthuốcláK326vàC9- 1bằngbằng mồi đặchiệuTMV-Fi-2/TSWV-Ri-1
M: thang DNA chuẫn 1 kb (Geneshun); +: đối chứng dương là plasmid TCYS;
-:đối chứng âm là cây không chuyển gene; 1-8: sản phẩm PCR từ DNA tổng số các dòng chuyển gene TCYS.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% thể hiện trong hình 3.8 cho thấy cỏc mẫu chạy đều xuất hiện một băng rừ nột cú kớch thước1000bp, đúng bằng kích thước của cấu trúc đoạn TCYS thiết kế ban đầu, chứngtỏnhững cây thuốc lá này có mang cấu trúc gene cầnchuyển.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã thiết kế thành công vector chuyển geneRNAimang gene chọn lọc mannose và 4 đoạn gene vỏ (coat protein-CP) của 4 loại virus TMV, CMV, TSWV và TYLCV(pK7M/TCYS).
2. Với nồng độ mannose 30 g/l là thích hợp cho chọn lọc cây thuốc lá chuyển gene mang gene chọn lọc mannose.
3. Chuyển thành công cấu trúc RNAi TCYS mang gene chọn lọc mannose vào giống thuốc lá K326 và C9-1, tỷ lệ cây chuyển gene kháng virus lần lƣợt là 51,67% và42,5%.
Kiến nghị
Tiếp tục theo dừi và đỏnh giỏ tớnh khỏng của cỏc mẫu thuốc lỏ chuyển gene ở thế hệ tiếp theo nhằm tạo đƣợc dòng thuốc lá có khả năng kháng TCYS ổn định qua nhiều thế hệ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO