2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Phương pháp PCR
a. PCR khuếch đại các đoạn gen gp5m, gp3, ltb từ các khuôn tương ứng
Với mục đích tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể trong việc chuyển tải kháng nguyên qua đường miệng, gen mã hóa cho protein LTB (Labile Toxin B subunit - độc tố không chịu nhiệt lấy từ vi khuẩn E. coli) đƣợc nối vào mỗi gen gp5m, gp3 bằng overlapping-PCR.
Để phục vụ cho phản ứng nối, trước tiên các gen gp5m, gp3, ltb được khuếch đại từ các khuôn tương ứng bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đã
đƣợc thiết kế đặc thù. Thành phần phản ứng và điều kiện chu trình nhiệt đƣợc mô tả trong Bảng 2.2 và Bảng 2.3.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các gen gp5m, gp3, ltb từ các khuôn tương ứng
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X MgSO4 25 mM
dNTPs 2 mM mỗi loại Mồi xuôi 10 pM Mồi ngƣợc 10 pM
Pfu ADN polymerase (5 U/àl) ADN khuôn
16.3 2.5 2.0 1.0 1.0 1.0 0.2 1.0
Tổng thể tích 25
Bảng 2.3: Mồi, ADN khuôn và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại các gen gp5m, gp3, ltb
Gen cần khuếch đại Mồi ADN khuôn Chu trình nhiệt
gp5m gp5-for
Vector pBSK-gp5m - Biến tính lần đầu : 94oC trong 5 phút
- Lặp lại 28 chu kỳ :
+ Biến tính : 94oC trong 30 giây
+ Gắn mồi : 52oC trong 30 giây
+ Tổng hợp : 72oC trong 90 giây
- Tổng hợp bước cuối : 72oC trong 10 phút.
cmyc-rev
ltb5 ltb-for
Vector pSHELP-ltb ltb5-rev
gp3 gp3-for
Vector pBSK-gp3 cmyc-rev
ltb3 ltb-for
Vector pSHELP-ltb ltb3-rev
Trong đó: ltb5: ltb dùng để nối với gen gp5m; ltb3: ltb dùng để nối với gen gp3.
b. Overlapping-PCR nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3
Sản phẩm PCR khuếch đại các gen phía trên đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng overlapping-PCR nhằm nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3. Phản ứng đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.4 và Bảng 2.5.
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X MgSO4 25 mM
dNTPs 2 mM mỗi loại Mồi ltb-for 10 pM Mồi cmyc-rev 10 pM
Pfu ADN polymerase (5 U/àl) ADN khuôn
32.5 5.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 2.0
Tổng thể tích 50
Bảng 2.5: Mồi, ADN khuôn và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng overlapping- PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3
Mục đích ADN khuôn Chu trình nhiệt
Nối gen ltb vào gen gp5m
- Sản phẩm PCR khuếch đại gen gp5m
- Sản phẩm PCR khuếch đại gen ltb5
- Biến tính lần đầu : 94oC trong 5 phút - Lặp lại 28 chu kỳ :
+ Biến tính : 94oC trong 30 giây + Gắn mồi : 52oC trong 30 giây Nối gen ltb
vào gen gp3
- Sản phẩm PCR khuếch đại gen gp3
- Sản phẩm PCR khuếch đại gen ltb3
+ Tổng hợp : 72oC trong 1 phút 40 giây
- Tổng hợp bước cuối : 72oC trong 10 phút có bổ sung 1 U Dream Taq ADN polymerase.
- Không bổ sung mồi ở 5 chu kì đầu tiên.
2.2.2.2. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
Sản phẩm PCR hoặc sản phẩm cắt ADN với enzyme giới hạn đƣợc tinh sạch từ gel (thôi gel) sử dụng bộ Kit “GeneJET Gel Extraction Kit ” (Thermo Scientific) theo các bước như sau [50] :
(1) Điện di hỗn hợp ADN trên gel agarose 1%, sử dụng máy soi gel cắt lấy băng ADN quan tâm từ bản gel bỏ vào các ống eppendorf 2 ml vô trùng.
Xác định khối lƣợng của mỗi miếng gel;
(2) Bổ sung dung dịch Binding theo tỷ lệ: Vmẫu : Vdd = 1 : 1 (100 àl dung dịch tương ứng với 100 mg mẫu). Ủ ở 600C đến khi miếng gel tan hoàn toàn;
(3) Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút, trong 1 phút;
(4) Loại bỏ dịch chảy qua cột;
(5) Bổ sung 700 àl dung dịch rửa;
(6) Ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút;
(7) Loại bỏ dịch chảy qua cột;
(8) Lặp lại bước (6), (7);
(9) Chuyển cột sang ống eppendorf vô trùng 1,5 ml;
(10) Để khô cột ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;
(11)Bổ sung 25 – 30 àl nước deion khử trựng vào chớnh giữa cột, giữ cột ở nhiệt độ phòng 2 phút, sau đó ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Thu lấy dịch chảy qua cột.
2.2.2.3. Phương phá p nối các đoạn ADN bằng enzyme nối T4 ADN ligase
Sản phẩm của phản ứng overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3 sau khi tinh sạch đƣợc đƣa vào vector pBT/T bằng phản ứng nối nhờ enzyme T4 ADN ligase với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT/T sử dụng enzyme T4 ADN ligase
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) H2O
Đệm T4 ADN ligase 10 X Enzyme T4 ADN ligase (5 U/àl) Vector pBT/T (100 ng/àl)
Sản phẩm PCR đã tinh sạch
2.0 1.0 1.0 1.0 5.0
Tổng thể tích 10
Ủ hỗn hợp ở 220C trong 2 giờ
2.2.2.4. Phương pháp biến
nap plasmid và o tế bà o vi khuẩn E. coli DH 5α
Để biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α chúng tôi sử dụng phương pháp sốc nhiêṭ . Đây là phương pháp đơn giản , phổ biến và tiên lơ
i để đƣa plasmid tái tổ hơp vaò tế baò vi khuân̉ . Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện theo theo Sambrook và Russell [46] với các bước như sau:
(1) Tế bào E. coli khả biến đƣợc lấy từ tủ -80oC, để tan trên đá trong 5 phút;
(2) Bụ̉ sung 10 àl sản phẩm nối, bỳng nhẹ, ủ trờn đỏ 30 phỳt;
(3) Sốc nhiêṭ hỗn hơp ở 42oC trong 60 giây;
(4) Đặt lại hỗn hợp trên đá 3 phút;
(5) Bổ sung 1 ml môi trường LB lỏng, chuyển hỗn hợp sang ống penicillin, ủ ở 37oC trong 20 phút sau đó lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 30 phút;
(6) Trải 200 àl dịch khuẩn lờn đia thac ̣ h có bụ̉ sung chất chọn lọc thớch hợp.
2.2.2.5. Phương pháp tách plasmid bằng SDS-kiềm
Quy trình tách plasmid bằng phương pháp biến tính kiềm được tiến hành theo Sambrook và Russell [46] với các bước như sau:
(1) Ly tâm 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm ở 10,000 vòng/phút trong 5 phút; bỏ dịch trong, thu lấy cặn tế bào;
(2) Hũa cặn trong 100 àl dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA pH 8), vortex, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút;
(3) Thờm 200 àl dung dịch II (0.2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ, ủ trờn đỏ 3 phỳt;
(4) Thờm 150 àl dung dịch III (3 M KOAc pH 5.2), ủ trờn đỏ 5 phỳt;
(5) Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong;
(6) Bổ sung 1 thể tích Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1), đảo nhẹ;
(7) Ly tâm hỗn hơp
dich pha trên; ở nhiệt độ phòng , 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu (8) Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol 100%, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong
20 phút;
(9) Ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa ADN;
(10) Rửa tủa bằng 0,5 ml cồn 70% lạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch trong;
(11)Để tủa khụ, hũa tan tủa trong 20 - 30 àl nước hoặc TE cú bổ sung RNase A đến nồng độ cuối cựng là 20 àg/ml.
2.2.2.6. Phương pháp kiểm tra kết quả biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Các khuẩn lạc m ọc trên đia thac ̣ h có b ổ sung kháng sinh chọn lọc bước đầu đƣợc kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR). Đây là phương pháp nhanh, đơn giản bởi sử dụng trực tiếp các tế bào vi khuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR.
Tuy nhiên, để có kết quả chính xác hơn, các khuẩn lạc dương tính từ phản ứng colony-PCR đƣợc nuôi lỏng qua đêm rồi tiến hành tách thu lấy plasmid. Sau đó tiến hành cắt các plasmid này với enzyme giới hạn thích hợp hoặc sử dụng chính
plasmid làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen, vector hoặc giữa gen và vector.
Trong nghiên cứu này, để kiểm tra kết quả nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT/T, bước đầu chúng tôi sử dụng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, sau đó các dòng cho kết quả PCR dương tính được nuôi lỏng qua đêm để tách thu lấy plasmid và cắt các plasmid này với enzyme giới hạn BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt đƣợc mô tả trong Bảng 2.7
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt plasmid với enzyme giới hạn BamHI.
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) H2O
Đệm enzyme BamHI 10 X Enzyme BamHI (10 U/àl) Plasmid tái tổ hợp
10.2 1.5 0.3 3.0
Tổng thể tích 15
Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ
2.2.2.7. Phương pháp thiết kế đoạn gen ltb-gp5
Theo tính toán ban đầu, đoạn gen gp5m đƣợc thiết kế có chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm ở hai đầu của gen m, do vậy để tạo ra đoạn gen nối ltb-gp5 chỉ cần cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme NcoI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt đƣợc minh họa trong Bảng 2.8.
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme giới hạn NcoI
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) H2O
Đệm enzyme NcoI 10 X Enzyme NcoI (10 U/àl) Vector pBT-ltb-gp5m
23.5 3.0 0.5 3.0
Tổng thể tích 30
Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ
2.2.2.8. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật GateWay
Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway, trước tiên các đoạn gen cần chuyển (ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3) đƣợc gắn các trình tự attB1, attB2 tương ứng vào hai đầu 5’, 3’ của gen bằng phương pháp PCR với cặp mồi attB1-ltb/attB2-cmyc (ngoài vùng trình tự đặc hiệu cho gen, các mồi này còn đƣợc gắn thêm trình tự attB1 hoặc attB2 ở đầu 5’). Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.9.
Bảng 2.9: Thành phần và điều kiện chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gắn các vị trí attB1, attB2 vào hai đầu của các gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3
Thành phần phản ứng Thể tớch (àl) Chu trỡnh nhiệt H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X
32.6
5.0 - Biến tính lần đầu: 94oC trong 5 phút
MgSO4 25 mM 4.0 - Lặp lại 28 chu kỳ :
dNTPs 2 mM mỗi loại 2.0 + Biến tính: 94oC trong 30
Mồi attB1-ltb 10 pM 2.0 giây
Mồi attB2-cmyc 10 pM Pfu ADN polymerase (5 U/àl) ADN khuôn (plasmid pBT
2.0 0.4 2.0
+ Gắn mồi: 58oC trong 30 giây
+ Tổng hợp: 72oC trong 1 phút 40 giây
mang đoạn gen tương ứng) - Tổng hợp bước cuối: 72oC trong 5 phút.
Tổng thể tích 50
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng cho phản ứng BP với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.10.
Bảng 2.10: Thành phần và điều kiện phản ứng BP
Thành phần phản ứng Thờ̉ tích (àl)
Nước 4.0
BP clonase mix 5X 2.0
Vector pDONR 201 ( 100 ng/àl) 2.0 attB1-ltb-gp5m-attB2 (100 ng/àl) 2.0 (hoặc attB1-ltb-gp5-attB2
hoặc attB1-ltb-gp3-attB2)
Tổng thể tích 10
Hỗn hơp ̣ đươc ̣ ủ ở 25oC trong 10 giờ
Tiếp theo, các vector pDONR 201-ltb-gp5m, pDONR 201-ltb-gp5, pDONR 201-ltb-gp3 thu đƣợc từ phản ứng BP đƣợc lai với vector pCB-GW-35S qua phản ứng LR. Thành phần và điều kiện phản ứng LR đƣợc minh họa trong Bảng 2.11.
Bảng 2.11: Thành phần và điều kiện phản ứng LR
Thành phần phản ứng Thờ̉ tích (àl)
Nước 4.0
LR clonase mix 5X 2.0
Vector pCB-GW-35S (100 ng/àl) 2.0 Vector pDONR 201-ltb-gp5m (100 ng/àl) 2.0 (hoặc Vector pDONR 201-ltb-gp5
hoặc Vector pDONR 201-ltb-gp3)
Tổng thể tích 10
Hỗn hơp ̣ đươc ̣ ủ ở 25oC trong 10 giờ
2.2.2.9. Phương phá p xá c điṇ h nồng độ axit nucleic [15]
Nồng độ axit nucleic được xác định bằng phương pháp đo quang phổ.
Cấu trúc vòng thơm của các ribonucleotide (hay nucleotide ) cấu tao nên ADN (hay ARN) tạo cho chún g có cườ ng đô ̣ hấp thu ̣ tia tử
ngoai (UV) cƣc đaị ơ
bướ c sóng 260 nm. Khi tia UV đươc chiêú qua dung dic ̣ h axit nucleic , mứ c hâṕ thu tia UV phu ̣
thuôc vào nồng đô ̣ của các axit nucleic . Đây chính là nguyên lý cơ bản của việc dùng máy quang phổ để xác định nồng độ axit nucleic .
Nồng độ axit nucleic đƣợc tính theo công thức:
C (àg/ml) = A260ìnìk Trong đó:
• C: Nồng độ axit nucleic;
• A260: Độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm;
• n: Số lần pha loãng mâu;
• k: Nồng độ axit nucleic (àg/ml) ứng với A260 là 1. (ADN: k=50, ARN:
k=40, oligonucleotide: k=25)
Khác với ADN và ARN, protein hấp thu ̣ tia tử ngoai ̣ cưc đai ̣ ở bước sóng 280 nm (chủ yếu do cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan tạo nên ). Do vậy, nồng độ và độ tinh sạch của mẫu axit nucleic có thể đƣ ợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). Đối với ADN, mẫu đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ lệ A260 /A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. Nếu có
protein, chỉ số này t hường thấp hơn 1,8. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì chế phẩm có thể lẫn nhiều ARN [15].
Ngoài ra nồng độ ADN còn được đánh giá ước lượng qua phương pháp điện di với thang chuẩn . Trong thang chuẩn , các băng đã đƣợc biết nồng độ do vậy khi
điên di
mâu với thang chuẩn trên cùng môt bản gel có thể ƣớc
lươn g nồng đô ̣ của
mâu nghiên cƣ́ u.
2.2.2.10. Phương pháp điện di axit nucleic trên gel agarose
Điện di là hiện tƣợng di chuyển của các phần tử mang điện tích trong một giá thể dưới tác dụng của dòng điện một chiều [15].
Phân tử axít nucleic tích điện âm do chứa gốc phosphate nên ở pH trung tính hoặc kiềm chúng sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dương với tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước hoặc trạng thái của phân tử. Đây là cơ sở để phân tách các đoạn ADN/ARN có kích thước, hình dạng khác nhau [14, 15].
Trong nghiên cứu này, phương pháp điện di axit nucleic trên gel agarose đƣợc thực hiện trong đệm TAE 1X [44] (45 mM Tris borate, 20 mM Acetic acid, 1 mM EDTA). Phương pháp nhuộm ethidium bromide được sử dụng nhằm phát hiện các phân tử ADN/ARN trên bản gel.
2.2.2.11. Biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 bằng phương pháp xung điện
Quy trình biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260 bằng phương pháp xung điện được thực hiện với các bước như sau [10, 43]:
(1) Lấy tế bào khả biến từ tủ -800C, đặt trên đá 5 phút cho tan;
(2) Bổ sung 1-2 àl plasmid vào hỗn hợp tế bào khả biến, bỳng nhẹ;
(3) Chuyển tất cả dịch trên vào cuvette xung điện;
(4) Xung điện ở điều kiện 2,5 kV, 25 àF, 400 Ω. Đặt ngay cuvette vào đỏ, ủ 5 phút;
(5) Bổ sung 500 àl LB lỏng và trộn nhẹ. Chuyển hỗn hợp sang ống penicillin;
(6) Hỗn hợp đƣợc lắc ở 200 vòng/phút, 28oC trong 1h;
(7) Trải 100 àl dịch khuẩn lờn mụi trường LB đặc cú chứa khỏng sinh kanamycin (50 àg/ml), rifamycin (25 àg/ml). Ủ đĩa khuẩn ở 28oC trong 48 giờ.
2.2.2.12. Phương pháp chuyển gen vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 sử dụng tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 [10]
a. Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào BY-2 và vi khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260 mang các vector chuyển gen
Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào thuốc lá BY-2
Năm ngày trước khi biến nạp, bắt đầu cấy chuyển: chuyển 1 ml tế bào BY-2 sang 50 ml môi trường mới, nuôi lắc trong tủ tối (tốc độ 120 vòng/phút) ở 28˚C.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260 mang các vector chuyển gen
Quá trình này gồm các bước như sau:
- Lấy chủng Agrobacterium gốc và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung các khỏng sinh: rifamycin (25 àg/ml), kanamycin (50 àg/ml), nuụi trong tủ ổn nhiệt 28˚C, 48 giờ;
- Từ đĩa cấy vạch trên chọn một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt và cấy vào 2 ml LB lỏng cú bổ sung cỏc khỏng sinh: rifamycin (25 àg/ml), kanamycin (50 àg/ml).
Bình nuôi lỏng đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ 28˚C qua đêm;
- Chuyển 0.5 ml dịch huyền phù đã nuôi qua đêm sang 20 ml LB lỏng (không chứa kháng sinh) để nuôi phục hồi cho đến khi vi khuẩn đạt OD600 khoảng 0.8 – 1.0.
b. Đồng nuôi cấy
Quá trình này được tiến hành theo các bước như sau:
- Hút 5 ml tế bào BY-2 vào mỗi đĩa petri;
- Bổ sung 5 àl acetosyringone 100 mM vào mỗi đĩa, lắc nhẹ nhàng. Acetosyringone là một hợp chất dễ bay hơi của phenol, có khả năng cảm ứng với các gen vir trong Ti-plasmid của A. tumefaciens. Đây là một trong những biện pháp làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen;
- Bổ sung 100 àl dịch khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector chuyển gen đạt giá trị OD600= 0.8 – 1.0, lắc nhẹ nhàng;
- Dán parafilm và ủ tối ở 25°C trong hai ngày.
c. Rửa khuẩn
Hai ngày sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành rửa khuẩn nhƣ sau:
- Trước khi thao tác, cắt đầu côn tránh làm tổn thương tế bào, hút tế bào BY- 2 từ mỗi đĩa pettri vào ống fancol 15 ml vô trùng;
- Thêm MS lỏng vào mỗi ống để đạt thể tích 14 ml và đảo nhẹ. Để lắng 15 phút, sau đó nhẹ nhàng hút bỏ phần dịch. Lặp lại 3 lần;
- Tiếp tục rửa với môi trường MS lỏng có bổ sung cefotaxim đến nồng độ sử dụng 500 àg/ml. Lặp lại 02 lần;
- Thêm môi trường lỏng có bổ sung cefotaxim đến 2 ml rồi đảo nhẹ nhàng;
- Lấy mỗi 1 ml dịch tế bào đã rửa sạch trải lên một đĩa thạch đã bổ sung cefotaxim 500 àg/ml và kanamycin 50 àg/ml. Dàn đều tế bào trờn mặt thạch, để khụ 5-10 phút trong tủ cấy vô trùng;
- Dán parafilm và ủ ở 25°C trong tối.
2.2.2.13. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ tế bào thực vật
Kết quả chuyển các đoạn gen quan tâm vào tế bào thuốc lá BY-2 đƣợc kiểm tra bằng phương pháp PCR trên khuôn là ADN tổng số với cặp mồi đặc hiệu cho gen. Quy trình tách ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau [10, 58]:
(1) Lấy 100 mg tế bào BY-2 cho vào ống effendorf 1.5 ml, nghiền cho tới khi thành dịch sệt;
(2) Bổ sung 500 àl dung dịch CTAB (1,5 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 8.0; 20 mM EDTA pH 8.0; 4% CTAB) vào từng ống, đảo đều, ủ 65˚C trong 1 giờ;
(3) Ly tâm hỗn hợp ở 13,000 vòng /phút trong 10 phút. Thu phần dịch nổi sang ống effendorf mới;
(4) Bổ sung 1 thể tích Chloroform:Isoamyl:Alcohol (25:24:1), đảo đều;
(5) Ly tâm hỗn hợp ở 13,000 vòng /phút trong 10 phút. Thu pha trên sang ống effendorf mới;
(6) Bổ sung 0.6 thể tích isopropanol 100%, đảo đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;