B: Trình tự axit amin
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT GATEWAY
3.3.2. Kết quả biến nạp các gen quan tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Tiến hành biến nạp với quy trình nhƣ đã mô tả trong mục 2.2.2.12, chúng tôi đã thu được kết quả bước đầu thể hiện trên Hình 3.14. Tiếp theo, các dòng phát triển tốt trên đĩa thạch được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR trên khuôn là ADN tổng số tách từ các tế bào BY-2 với các cặp mồi đặc hiệu cho từng gen.
Hình 3.14: Kết quả bước đầu chuyển gen quy định kháng nguyên PRRSV vào tế bào thuốc lá BY-2. A: 3 tuần sau khi rửa khuẩn; B: Các dòng phát triển tốt trên môi trường có kháng sinh chọn lọc được chuyển sang môi trường chọn lọc mới; C: 1 tuần sau khi chuyển sang môi trường mới; D:3 tuần sau khi chuyển sang môi trường mới.
3.3.2.1. Kết quả sàng lọc các dòng tế bào thuốc lá BY-2 mang gen cần chuyển bằng phương pháp PCR
a. Kết quả tách ADN tổng số
Các dòng phát triển tốt trên đĩa thạch có kháng sinh chọn lọc đƣợc đem tách ADN tổng số với quy trình nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.2.13. Điện di sản phẩm tách chiết trên gel agarose 0.8% cho kết quả nhƣ Hình 3.15.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình 3.15. Ảnh điện di minh họa kết quả tách ADN tổng số trên gel agarose 0.8%.
Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số đạt chất lƣợng tốt, có thể sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển.
b. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho từng gen
Dựa trên khuôn là ADN tổng số tách từ mỗi dòng tế bào, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển. Cặp mồi sử dụng là cặp mồi đặc hiệu cho gen. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho kết quả nhƣ sau:
- Kết quả chuyển đoạn gen ltb-gp5m
Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR là cặp mồi đặc hiệu cho gen ltb-gp5m, sẽ cho sản phẩm PCR với kích thước khoảng 1600 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 3.16) cho thấy chúng tôi thu được 27/40 dòng lên băng với kích thước khoảng 1600 bp, do vậy có thể kết luận những dòng này đã mang gen ltb-gp5m.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
1500 bp
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M
1500 bp
Hình 3.16: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen ltb-gp5m trong các dòng tế bào BY-2 trên gel agarose 1%. 1-40: Kí hiệu các dòng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun).
- Kết quả chuyển đoạn gen ltb-gp5
Theo tính toán, sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ltb-gp5 mà chúng tôi sử dụng sẽ có kích thước khoảng gần 1000 bp. Ảnh điện di sản phẩm PCR (Hình 3.17) cho thấy các dòng từ 1-11, 13-17 đều lên băng với kích thước đúng nhƣ tính toán, chứng tỏ những dòng tế bào này đã đƣợc chuyển đoạn gen ltb- gp5.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M - 13 14 15 16 17 M
1000 bp
Hình 3.17: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen ltb-gp5 trong các dòng BY-2 trên gel agarose 1%. 1-17: Kí hiệu các dòng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun); M: Thang chuẩn ADN Smart (Eurogentec).
- Kết quả chuyển đoạn gen ltb- gp3
Cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho gen này sẽ cho sản phẩm PCR với kích thước khoảng hơn 1000 bp. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR (Hình 3.18) cho thấy cả 6 dòng mà chúng tôi kiểm tra đều lên băng ADN với kích thước tương tự, chứng tỏ những dòng này đã mang đoạn gen ltb-gp3.
1 2 3 4 5 6 M
1000 bp
Hình 3.18: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen ltb-gp3 trong các dòng BY-2 trên gel agarose 1%. 1-6: Kí hiệu các dòng BY-2; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Sciencetific).
Qua sàng lọc bằng PCR, chúng tôi đã thu được 27 dòng dương tính trong trường hợp chuyển đoạn gen ltb-gp5m, 23 dòng dương tính trong trường hợp chuyển đoạn gen ltb-gp5 và 6 dòng dương tính trong trường hợp chuyển đoạn gen ltb-gp3 vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2.
3.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN CẦN CHUYỂN TRONG