CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.3. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Mẫu bệnh phẩm
Các mẫu dịch ngoáy họng, dịch nốt phỏng, phân, ngoáy hậu môn đƣợc bảo quản trong 1ml môi trường vận chuyển virus do khoa nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm chuẩn bị theo quy tình của tổ chức y tế thế giới
Các mẫu dịch tỵ hầu, dịch nội khí quản, dịch não tủy đƣợc đựng trong ống vô trùng do khoa nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm cung cấp.
Trong nghiên cứu của mình chúng tôi đã thu thập đƣợc 305 bệnh phẩm: 207 dịch ngoáy họng,60 phân, 15 dịch nội khí quản,12 dịch tỵ hầu, 11 dịch não tủy.
Trong đó, 10 bệnh nhân có 4 loại bệnh phẩm (dịch tỵ hầu, dịch nội khí quản, phân, dịch não tủy), 20 bệnh nhân có dịch ngoáy họng và phân, 225 bệnh nhân chỉ có 1 loại bệnh phẩm (187 bệnh nhân chỉ có dịch họng, 30 bệnh nhân chỉ có mẫu phân, 5 bệnh nhân chỉ có nội khí quản, 2 bệnh nhân chỉ có dịch tỵ hầu, 1 bệnh nhân chỉ có dịch não tủy).
2.3.2. Sinh phẩm và hóa chất
2.3.2.1. Môi trường vận chuyển virus (PBS-Glycerol transport medium)
• Phosphate-buffered saline (PBS):
− NaCl : 8g
− KCl : 0,2g
− Na2HPO4 : 1,44g
− KH2PO4 : 0,24g
− Thêm nước cất đã khử trùng để thành 1 lít
• Trộn dung dịch trên với glycerol đã khử trùng theo tỷ lệ 1 : 1 thành 1 lít
• Trong 1 lít BPS & glycerol trên cho thêm vào:
− benzylpenicillin (2 x 106 IU/lit)
− streptomycin (200 mg/lit)
− polymyxin B (2 x 106 IU/lit)
− gentamicin (250 mg/lit)
− nystatin (0.5 x 106 IU/lit
− ofloxacin hydrochloride (60 mg/lit)
− sulfamethoxazole (0,2 g/lit)
2.3.2.2. Sinh phẩm cho phản ứng sinh học phân tử
Dưới đây là các hóa chất và sinh phẩm được dùng trong nghiên cứu:
Bảng 2.1: Sinh phẩm và hóa chất dùng trong nghiên cứu
TT Tên sinh phẩm Hãng sản xuất Mục đích
1 QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen Tách chiết RNA 2 Quantitect® Probe RT-PCR
kit Qiagen Realtime RT-PCR
3 Onestep RT-PCR kit Qiagen RT-PCR
4 Mồi xuôi và mồi ngƣợc
(primer) Invitrogen RT-PCR và realtime
RT-PCR
5 Đầu dò (Probe) Invitrogen Realtime RT-PCR
6 Generuler 100bp Fermentaq Điện di
7 Buffer TBE 1x Applichem Điện di
8 Agarose Invitrogen Điện di
9 Loading dye Fermentag Điện di
8 Red safe ABM Điện di
Các cặp mồi và Probesử dụng trong nghiên cứu có trình tự nhƣ sau:
Bảng 2.2: Trình tự mồi và probe đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Đích Mồi hoặc Probe Trình tự
RT-PCR MD 90 5’-ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA-3’
EVs MD 91 5’-CCT CCG GCC CCT GAA TGC GGC TAA T-3’
Realtime RT-PCR
EVs
VP0_F 5’-CCC TGA ATG CGG CTA ATC C-3’
VP0_R 5’-ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA-3’
VP0_P (FAM)5’-AAC CGA CTA CTT TGG GTG TCC GTG TTT C-3’ (TAMRA)
RT-PCR MAS01 5’-TAATAGCA(C/T)T(A/G)GCGGCAGCCCA -3’
EV71 MAS2A 5’-AGAGGGAG(A/G)TCTATCTC(C/T)CC -3’
Realtime RT-PCR EV71
EV71-VP1-634F 5’- GGAGAACACAARCARGAGAAAGA- 3’
EV71-VP1-743R 5’- ACTAAAGGGTACTTGGACTTVGA- 3’
EV71-VP1- TaqMan
(FAM)5’-TGATGGGCACGTTCTCAGTGCG- 3’(BHQ1)
2.3.3. Trang thiết bị
Box an toàn sinh học BioSafety cấp II
Bộ micropipette với cỏc thể tớch 1000àl, 200àl , 100àl , 20àl và 10àl cựng cỏc đầu cụn cú phin lọc 1000àl, 200àl, 100àl, 20àl, 10 àl Ống Eppendorf ở các thể tích khác nhau: 2ml, 1.5ml, 0.2ml Máy Votex MS2 Minishaker (IKA)
Máy li tâm lạnh Eppendorf 5424 Box mix PCR
Máy Realtime PCR BioRad iQ5
Máy PCR ABI
Bộ điện di MUPid Extra Máy soi gel Biorad Nồi khử trùng Tommy
2.3.4. Các bước tiến hành chẩn đoán
2.3.4.1. Tách chiết RNA tổng số bằng kit QIAamp Viral RNA mini kit
Nguyên lý: QIAamp Viral Mini Kits đã đưa ra phương pháp tách chiết RNA virus chung. Kit kết hợp màng silicagel có khả năng gắn chọn lọc với công nghệ máy ly tâm loại nhỏ hoặc máy hút chân không đồng thời cũng là một phương pháp lý tưởng cho việc tách chiết nhiều mẫu một lúc.
Quy trỡnh tỏch chiết này dựng để tỏch chiết RNA tổng số từ 140 àl plasma, serum, nước tiểu, môi trường nuôi cấy tế bào, hoặc các dịch vô trùng trên cơ thể sử dụng máy li tâm loại nhỏ. Nếu sử dụng lƣợng mẫu ban đầu lớn hơn trong quá trình tiến hành sẽ đƣa mẫu lên cột nhiều lần hơn.
Cỏc bước chuẩn bị: Nhỏ 310 àl đệm AVE vào ống carriercú chứa 310 àg lyophilized carrier RNA để thành dung dịch cú 1 àg/ àl rồi cho toàn bộ 310 àl AVE có chứa carrier vào lọ chứa 31ml AVL
Thêm 125ml cồn 96% - 100% vào 95 ml AW1, 160 ml cồn 96% - 100% vào 66 ml AW2.
• Các bước tiến hành:
Nhỏ 560 àl đệm AVL cú chứa carrier vào ống eppendoft cú thể tớch 1.5ml.Thờm 140 àl mẫu cần tỏch RNA vào ống trờn rồi voltex trong 15 giõy để tạo thành một dung dịch đồng nhất.
Ủ hỗn hợp gồm mẫu và AVL có chứa carrier ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tõm nhẹ để loại bỏ hết cỏc hạt chất lỏng nhỏ trờn lắp ống.Thờm 560 àl cồn (96%-100%) vào mẫu, rồi voltex thật kỹ trong 15 giây.
Hỳt thật cẩn thận 630 àl hỗn hợp mẫu, cồn và AVL lờn trờn cột QIAamp Mini trỏnh không để ƣớt miệng côt.Đậy nắp, ly tâm cột ở 8000rpm/phút.
Lấy cột ra và đặt vào ống collection, loại bỏ ống collection có chứa dịch thải.Lặp lại bước hút mẫu vừa rồi.
Nhỏ 500 àl AW1, đậy nắp và tiếp tục ly tõm 8000 rpm/1 phỳt.Loại bỏ ống collection có chứa dịch thải, đặt cột vào ống collection mới.
Thờm 500 àl AW2 vào cột, li tõm ở 13000rpm/ 3 phỳt.
Cuối cựng đặt cột vào ống eppendoft 1,5ml loại bỏ dịch thải và thờm 60 àl AVE vào cột và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 8000rpm/phút. RNA đã tách chiết đƣợc lưu giữ trong ống eppendoft này, có thể lưu giữ 1 năm trong tủ -20oC hoặc-70oC 2.3.4.2. Phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán EVs và EV71
RNA của EVs được chẩn đoán bằng hai phương pháp đang được ứng dụng rộng rãi hiện nay là phương pháp RT-PCR và Realtime RT-PCR. Từ kết quả có được chúng tôi sẽ so sánh để tìm ra phương pháp tối ưu ứng dụng trong chẩn đoán EVs.
• Phương pháp RT-PCR
Từ công trình nghiên cứu của Romero JR và Rotbart HA và cộng sự [37]
chúng tôi sử dụng cặp mồi MD 90 và MD 91 để khuếch đại đoạn gen có kích thước 154 bp nằm trong vùng 5’ không dịch mã. Phản ứng sử dụng bộ kit Onestep RT- PCR kit của Qiagen với cỏc thành phần sau (mỗi phản ứng cú tổng thể tớch 25 àl):
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đoán EVs
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O
QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer, 5x MgCl2
dNTP mix (10mM mỗi loại) MD 90 (10 ρmol)
MD 91 (10 ρmol)
QIAGEN Onestep RT-PCR Enzym mix RNA khuôn
9,5 5,0 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 5,0
Tổng thể tích 25
Hỗn hợp phản ứng đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy PCR ABI 9700 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR chẩn đoán EVs Bước Nhiệt độ (to) Thời gian (phút) Số chu kỳ
1 50 30 1
2 95 10 1
3 95 1
4 60 1 30
5 72 1
6 72 7 1
Sản phẩm RT-PCR sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1,5%, đệm TBE 1x trong 30 phút và sử dụng thang điện di 100bp
Đọc kết quả: Các mẫu có băng cùng kích thước với mẫu chứng dương được cho là dương tính. Các mẫu có băng khác kích thước hay không có băng được cho là âm tính
• Phương pháp realtime RT-PCR
Ứng dụng kỹ thuật realtime RT-PCR trong việc chẩn đoán EVs để khuếch đại đoạn gen có kích thước 110bp trên vùng gen 5'UTR sử dụng cặp mồi EV-VP0- F, EV-VP0-R và đầu dò EV-VP0-probe-FAM [46]sử dụng kít Quantitect® Probe RT- PCR kit. Mỗi phản ứng (25 àl) bao gồm những thành phần sau đõy:
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đoán EVs
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O cất khử trùng, khử ion
Quantitect probe RT-PCR master mix (2x) VPO-F (10 ρmol)
VPO-R (10 ρmol) VPO-P (10 ρmol)
Quantitect probe RT-PCR Enzyme mix RNA khuôn
3,75 12,5 1,50 1,50 0,50 0,25 5,00
Tổng thể tích 25,0
Hỗn hợp các thành phần hóa chất trên đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy Realtime PCR BioRad iQ5 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.6: Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR chẩn đoán EVs Bước Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 46 30 phút 1
2 95 15 phút 1
3 95 15 giây
4 58 1 phút 45
Đọc kết quả: Các mẫu có Ct nhỏ hơn 40 được cho là dương tính
Một số mẫu dương tính được định lượng dựa trên dãy pha loãng đã biết trước nồng độ từ đại học Gothenburg - Thụy điển. Dãy pha loãng có nồng độ nhƣ sau:
Chuẩn S1 S2 S3 S4
Nồng độ (copies/ml) 1600000 400000 100000 25000
2.3.4.3. Phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán EV71
• Phương pháp RT-PCR
Từ công trình nghiên cứu của Phan Van Tu và cộng sự [36] chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn gen đích VP1 với cặp mồi MAS01 và MAS2A sử dụng kít QIAGEN Onestep RT-PCR bằng phương phỏp RT-PCR. Mỗi phản ứng PCR (25àl) bao gồm những thành phần sau đây:
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đoán EV71
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O
QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer, 5x MgCl2
dNTP mix (10mM mỗi loại) MAS01 (10 ρmol)
MAS2A (10 ρmol)
QIAGEN Onestep RT-PCR Enzym mix RNA khuôn
9,5 5,0 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 5,0
Tổng thể tích 25
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR ABI 9700. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh về nhiệt độ, thời gian ủ và thời gian kéo dài sao cho phù hợp.
Bảng 2.8: Chu trình nhiệt cho phản úng RT-PCR EV71 Bước Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1
2 95 10 phút 1
3 95 30 giây
4 57 45 giây 35
5 72 45 giây
6 72 7 phút 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1x trong 30 phút và sử dụng thang điện di 100bp
Đọc kết quả: Các mẫu có băng đích cùng kích thước với mẫu chứng dương được cho là dương tính. Các mẫu có băng đích không cùng kích thước hay không có băng đích đƣợc cho là âm tính
• Ứng dụng phương pháp Realtime RT-PCR
Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR trong việc chẩn đoán EV71sử dụng cặp mồi EV71-VP1-634F và EV71-VP1-743R và đầu dò EV71-VP1-TaqMan [43]
trong vùng gen VP1 sử dụng kít Quantitect® Probe RT-PCR kit. Mỗi phản ứng (25 àl) bao gồm những thành phần sau đõy:
Bảng2.9: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đán EV71
Thành phần Thể tớch (àl)
H2O cất khử trùng, khử ion
Quantitect probe RT-PCR master mix (2x) EV71-VP1-634F (10 ρmol)
EV71-VP1-743R (10 ρmol) EV71-VP1-TaqMan(10 ρmol)
Quantitect probe RT-PCR Enzyme mix RNA khuôn
3,75 12,5 1,50 1,50 0,50 0,25 5,00
Tổng thể tích 25,0
Hỗn hợp các thành phần hóa chất trên đƣợc voltex nhẹ, spindown rồi đƣa vào máy Realtime PCR BioRad iQ5 chạy với chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.10 : Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR chẩn đoán EV71 Bước Nhiệt độ (toC) Thời gian Số chu kỳ
1 46 30 phút 1
2 95 15 phút 1
3 95 15 giây
4 58 1 phút 45
Đọc kết quả: Các mẫu có Ct nhỏ hơn 40 được cho là dương tính.
2.3.4.4. Phương pháp điện di
Nguyên lý: Điện di là một kỹ thuật đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta sử dụng phương pháp điện di để tách ly các phân tử DNA tổng số, các đoạn DNA cắt giới hạn, các sản phẩm PCR. DNA là một phân tử tích điện âm và di chuyển do dòng điện chạy qua bản gel agarose từ cực âm sang cực dương. Trên cùng một bản gel, trong cùng một điện trường, các phân tử DNA khác nhau về kích thước, khối lượng và do đó sẽ khác nhau về điện tích sẽ di chuyển được quãng đường khác nhau trong cùng một thời gian cho dòng điện chạy qua gel. Sau khi nhuộm ethidium bromide người ta sẽ phân biệt các DNA có khối lượng khác nhau trên cùng một bản gel. Qua đó có thể so sánh DNA đang cần phân tích với các mẫu DNA chuẩn đƣợc biết trước khối lượng phân tử hoặc phân tách được các phân tử DNA có khối lượng khác nhau.
Các bước tiến hành:
Cân 1,5g agarose cho vào trong 100ml đệm TBE 1x
Để ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi đƣa vào lò vi sóng đun cho tan hoàn toàn
Làm nguội gel đến khoảng 60oC, thờm 5 àl Redsafe lắc đều rồi đổ gel ra khay và lắp lƣợc
Khi gel nguội, tháo lƣợc, cho khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 1x vào bể điện di sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5mm
Trộn sản phẩm PCR và loading dye rồi cho vào các giếng trên gel agarose Cắm điện cực và điện di DNA trong 30 phút ở 100V
Chụp kết quả điện di trong ánh sáng uv