Các mẫu dẫn xuất N-alkylisatin 4-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucopyranosyl)- thiosemicarbazon đƣợc cân với một lƣợng nhƣ nhau (0,002 g) và pha vào 5ml dung môi DMF.
b. Môi trường thử
Miieller-Hinton(MH) Sabourous(SBR) Thạch tương (TT).
c.Vi sinh vật
Các vi sinh vật đƣợc sử dụng để thăm dò hoạt tính sinh học là trực khuẩn Gram-(–) Escherichia coli, cầu khuẩn Gram-(+) Staphyl°C°Cous aureus, nấm men Candida albicans.
Cách làm: Láng vi khuẩn và nấm đã nuôi cấy lên bề mặt của môi trường (MH, SBR, TT) trên đĩa canh thang nuôi cấy qua đêm ở tủ ấm 37oC, đục lỗ và nhỏ thể tích dung dịch tương ứng (100 l và 150l) dung dịch chất thử, để trong tủ ấm 37oC khoảng 18-24 giờ, sau đó đọc kết quả bằng việc đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm), phối hợp với các phương pháp tính toán để khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất này. Kết quả thử hoạt tính sinh học đƣợc dẫn ra trong Bảng 3.9.
Nhận xét chung:
Nhìn chung ở 50 μl thì các hợp chất chƣa thể hiện hoạt tính sinh học nhƣng ở 100 μl và 150 μl thỡ hầu hết cỏc dẫn xuất này đều thể hiện hoạt tớnh sinh học rừ rệt với vòng vô khuẩn nhƣ sau:
• Kháng trực khuẩn Gram-(-) E.coli với vòng vô khuẩn từ 16-19 mm ở 100 μl và
28-30 mm ở 150 μl.
• Kháng cầu khuẩn Gram-(+) S.aureus đường kính vòng vô khuẩn là 0 mm khi ở 100 μl và 10-18 mm ở 150 μl (trừ trường hợp nhóm thế là ethyl thì không thể hiện hoạt
68
tính sinh học với kháng cầu khuẩn Gram-(+).
• Nấm men Candida albicans với vòng vô khuẩn từ 15-21 mm ở 100 μl và 28-32 mm ở 150 μl.
Bảng 3.8. Kết quả thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật của các N-alkylisatin 4- (2,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucopyranosyl)thiosemicarbazon (4a-i)
STT R
ĐưĐườờnngg kkíínnhh vvòònngg vvôô kkhhuuẩnẩn ((mmmm))
E.coli S.aureus C.albican
50μL 100μL 150μL 50μL 100μL 150μL 50μL 100μL 150μL
4a CH
3 0 17 30 0 0 15 0 20 32
4b C
2H
5 0 18 28 0 0 0 0 18 30
4f i-C
4H
9 0 16 30 0 0 18 0 17 30
4g C
3H
5 0 19 30 0 0 10 0 15 28
4h C6H
5CH
2 0 18 29 0 0 14 0 21 32
Như vậy: Khi thay đổi lƣợng sản phẩm từ 100L sang 150L, một số sản phẩm có sự thay đổi về hoạt tính sinh học với đường kính vòng vô khuẩn tăng lên đáng kể.
Nhƣng cũng có sản phẩm thì sự thay đổi là ít hoặc không đáng kể. Những sản phẩm này có hoạt tính sinh học mạnh hơn.
3.5.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH a) Chuẩn bị mẫu.
Các dẫn xuất N-ankylinsatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon và chất chuẩn resveratrol đƣợc pha trong etanol thành các dung dịch có nồng độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; và 12,0 mM. DPPH đƣợc pha trong ethanol thành
69
dung dịch có nồng độ 150 μM bằng cách hòa tan 5,9 mg DPPH trong 100 ml ethanol.
b) Phương pháp tiến hành
Trờn đĩa ELISA 96 giếng, sử dụng micropipet thờm lần lƣợt 5 àL cỏc dung dịch mẫu thử, chất chuẩn (positive control) đã pha sẵn vào cỏc giếng thử cú chứa 195 àL dung dịch DPPH 150 mM. Các giếng chứa mẫu DPPH đối chứng (negative control) đƣợc pha bằng cỏch thờm 5àL ethanol trong 195 àL dung dịch DPPH 150 μM. Mẫu trắng (blank sample) là cỏc giếng chứa 200àL etanol. Lắc nhẹ đĩa cho cỏc dung dịch trộn đều vào nhau và đƣa vào buồng ủ ở 25oC trong vòng 30 phút. Tiến hành đo độ
hấp thụ của các dung dịch trong các giếng thu được tại bước sóng 518 nm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình và tính toán giá trị hiệu quả ức chế của các mẫu thử.
c) Kết quả và thảo luận
Tác dụng chống oxi hóa của các glucopyranosylthiosemicarbazon đƣợc khảo sát dựa theo phương pháp bắt giữ gốc tự do DPPH [16,41]. Phương pháp này được phát triển bởi Blois dựa vào tính bền vững của gốc tự do DPPH. Ở trạng thái gốc tự do, cặp electron tự do trên nguyên tử N đƣợc giải tỏa bởi sự liên hợp toàn phân tử.
Chính vì vậy, mà nó ít bị dime hóa như các gốc tự do bình thường và có thể tồn tại ở dạng đơn phân tử. Một đặc điểm nữa đó là ở trạng thái gốc tự do, DPPH có màu tím, hấp thụ tử ngoại với băng sóng cực đại trong dung dịch ethanol ở khoảng 518 nm. Khi có mặt chất có khả năng bắt gốc tự do, DPPH sẽ chuyển sang dạng khử và màu tím sẽ nhạt dần, chuyển sang màu vàng nhạt, độ hấp thụ thay đổi. Dựa trên sự khác biệt này người ta có thể tính lượng gốc tự do DPPH bị chuyển sang dạng khử (bị bắt giữ) từ đó cho phép đánh giá giá trị chống oxi hóa của chất thử. Các mẫu thử và chất chuẩn đƣợc pha sẵn và khảo sỏt ở sỏu nồng đụ̣ khỏc nhau: 12,5; 25; 50; 100; 200; và 300 àM. Phộp thử đƣợc tiến hành trên các đĩa ELISA 96 giếng và đo độ hấp thụ (hình 3.4).
Giá trị hiệu quả bắt giữ gốc tự do (hiệu quả ức chế) đƣợc tính theo công thức:
Hiệu quả ức chế (%) = ADPPH - Amẫu
ADPPH - Aetanol x 100
70
Trong đó: ADPPH là giá trị độ hấp thụ của các giếng chỉ chứa dung dịch DPPH Amẫu là giá trị độ hấp thụ của các giếng chứa mẫu, chất chuẩn Aetanol là giá trị độ hấp thụ của các giếng chứa etanol (mẫu trắng)
Từ giá trị hiệu quả ức chế nhận đƣợc, xây dựng đồ thị phụ thuộc giữa hiệu quả ức chế và nồng độ chất thử, xử lý số liệu trên excel và phần mềm GraphPad Prism (version 5.0) để tính toán giá trị % gốc tự do bị bắt giữ theo nồng độ có tác dụng 50%, EC50 (half maximal effective concentration), trong trường hợp này là giá trị hiệu quả bắt giữ 50% gốc tự do DPPH, của mỗi mẫu thử (xem Bảng 3.9).
Bảng 3.9. Giá trị hiệu quả bắt giữ 50% gốc tự do (EC50) của các dẫn xuất N- ankylinsatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon
STT Ký hiệu mẫu EC50 (g/ml)
1 Glc-N-CH3 - Insatin >128
2 Glc-N-C2H5 - Insatin >128
3 Glc-N-C3H5 - Insatin >128
4 Glc-N-i-C4H9 - Insatin >128
5 Glc-N-n-C4H9 - Insatin >128
6 Glc-N-n-C3H7 - Insatin >128
7 Glc-N-C6H5 - CH2 Insatin >128 8 Glc-N-C6H5 - CH2CH2 Insatin >128
9 Insatin >128
Tham khảo Resveratrol 14.36
Kết quả nhận đƣợc cho thấy các hợp chất tổng hợp đều không thể hiện khả năng bắt gốc tự do. Các giá trị EC50 tính đƣợc cao hơn so với chất chuẩn resveratrol (có giá trị là 14.36 g/ml), cho thấy các chất này khả năng bắt giữ gốc tự do yếu. Do đó, các N-ankylinsatin (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) thiosemicarbazon là các chất chống oxi hóa kém.