Kết quả giải phẫu thân hoàng đằng được thể hiện trong hình 3.1
Hình 2.4. Bộ chiết Soxhlet
Ngoài cùng của thân là lớp bần (phần 1 trong hình 3.1) với nhiều lớp tế bào xếp đều đặn, màng dày tạo thành các vòng đồng tâm, bắt màu xanh với thuốc nhuộm xanh metylen.
Tiếp theo là lớp tế bào mô mềm vỏ (phần 2 trong hình 3.1) gồm những tế bào màng mỏng có hình gần tròn, hình trứng hay hình chữ nhật, bắt màu đỏ với cacmin.
Phía trong là các tế bào mô cứng tập trung tạo thành các vòng mô cứng (phần 3 trong hình 3.1), liên tục uốn lượn theo các bó libe, gỗ. Phần này gồm những tế bào thành dày, khoang rộng.
Tiếp đến là bó libe cấp 2 (phần 4 trong hình 3.1) , thường bị khô và chỉ còn lại những khoang trống.
Tương ứng với từng bó libe cấp 2 là từng bó gỗ cấp 2 (phần 5 trong hình 3.1).
Bó gỗ gồm nhiều mạch gỗ to, nhuộm màu xanh. Rải rác có các tế bào mô cứng (phần 7 trong hình 3.1).
Giữa các bó libe gỗ có những tia ruột xếp đều đặn thành hình nan quạt (phần 6 trong hình 3.1).
Mô mềm ruột (phần 8 trong hình 3.1) gồm những tế bào tròn hay nhiều cạnh bắt màu đỏ.
3.2. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của cây hoàng đằng 3.2.1. Độ ẩm
Hình 3.1. Giải phẫu thân hoàng đằng
Thân cây hoàng đằng khô tiến hành xác định độ ẩm. Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm
STT m1(g) m2(g) m3(g) W(%) Wtb (%)
1 44,896 2,008 46,774 6,481
6,480
2 34,181 2,035 36,084 6,493
3 30,046 2,067 32,339 6,472
4 43,055 2,024 44,948 6,483
5 45,483 2,011 47,364 6,456
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của thân cây hoàng đằng khô là 6,480%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp theo chuyên luận dược liệu hoàng đằng của Dược điển Việt Nam IV là 14% [2].
3.2.2. Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu hoàng đằng đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 400-4500C để xác định hàm lượng tro. Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên.
Kết quả xác định hàm lượng tro trung bình được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro
Vậy hàm lượng tro trung bình là: 3,449%. Căn cứ theo chuyên luận dược liệu hoàng đằng của Dược điển Việt Nam IV về hàm lượng tro là không quá 5%
STT m1 (g) m2 (g) m4 (g) % tro (%)
Hàm lượng tro trung
bình:
3,449%
1 44,896 2,008 44,957 3,038
2 34,181 2,035 34,249 3,342
3 30,046 2,067 30,479 3,532
4 43,055 2,024 43,129 3,656
5 45,483 2,011 45,557 3,680
thì hàm lượng tro của cây hoàng đằng thu hoạch ở xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum hoàn toàn phù hợp.
Trong thành phần của tro vô cơ có thể có mặt của các muối của một số kim loại như K, Na, Ca, Fe, Cu, Pb, Zn… Sự có mặt của các kim loại này có thể ảnh hưởng đến tính chất của các dịch chiết từ thân hoàng đằng với các phương pháp chiết khác nhau.
3.2.3. Hàm lượng một số kim loại
Tro thu được sau khi nung các mẫu mang hòa tan bằng dung dịch axit HCl:HNO3 (1:3) loãng và định mức bằng nước cất trong bình định mức 50ml, sau đó xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung bộ, số 660, Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng.
Kết quả phân tích được trình bày trên bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng hàm lượng một số kim loại trong cây hoàng đằng
Kim loại
Hàm lượng kim loại (mg/kg)
TCVN 3572 - 81 và theo quyết định Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 4/4/1998 (mg/kg)
Fe 3,125 5,0
Hg 0,025 0,4
Pb 0,055 2
Căn cứ vào quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 4/4/1998 (mg/kg) về một số tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả khô đối với Fe: 5mg/kg, Hg: 0,4 mg/kg, Pb:
2mg/kg thì hàm lượng kim loại trong thân hoàng đằng không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người vì hàm lượng các kim loại nặng trong thân hoàng đằng là Fe:
3,125mg/kg, Hg: 0,025mg/kg, Pb: 0,055mg/kg.
3.3. Kết quả định tính, định lượng ankaloit trong dược liệu hoàng đằng
3.3.1. Kết quả định tính
- Kết quả quan sát lát cắt dược liệu dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm được thể hiện trong hình 3.2.
Dưới ánh sáng tử ngoại, lát cắt dược liệu hoàng đằng phát quang màu vàng tươi.
- Kết quả quan sát dịch chiết hoàng đằng với dung môi etanol 90% dưới kính hiển vi được thể hiện trong hình 3.3.
Khi quan sát dịch chiết hoàng đằng với dung môi etanol 90%, dưới kính hiển vi thấy xuất hiện tinh thể có hình dạng như trong hình 3.3.
Kết quả thu được từ 2 thí nghiệm định tính đúng theo chuyên luận dược liệu hoàng đằng của Dược điển Việt Nam IV.
3.3.2. Kết quả định lượng
Hình 3.2. Dược liệu hoàng đằng dưới ánh sáng tử ngoại khi được quan sát
Hình 3.3. Dịch chiết hoàng đằng
dưới kính hiển vi Hình 3.4. Kính hiển vi OLYMPUS CX21
Kết quả định lượng ankaloit trong dịch chiết dược liệu hoàng đằng với dung môi etanol 96% được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định lượng ankaloit Khối lượng
bột hoàng đằng ban đầu
(g)
Độ ẩm (%)
Khối lượng bột hoàng đằng đã trừ
độ ẩm (g)
Khối lượng cắn thu được
Hàm lượng ankaloit (%)
10,023 6,480 9,374 0,255 2,720
Hàm lượng ankaloit trong dược liệu hoàng đằng ở xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum là 2,720%. Kết quả này phù hợp với hàm lượng ankaloit của dược liệu hoàng đằng trong chuyên luận dược liệu của Dược điển Việt Nam IV là lớn hơn 1%.
3.4. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu hoàng đằng với các dung môi khác nhau bằng phản ứng với các thuốc thử
Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu hoàng đằng với các dung môi khác nhau bằng phản ứng với các thuốc thử được thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong dịch chiết cây hoàng đằng với các dung môi khác nhau
Nhóm hợp chất
Thuốc thử Cách thực hiện
Phản ứng dương tính
Kết quả định tính trên các dịch chiết
Kết quả định
tính chung
Dịch chiết ete
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không
thủy phân
Thủy phân
Không thủy phân
Thủy phân
Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ (+) Có
Carotenoid
H2SO4 đđ Xanh dương hay xanh lục
ngã sang xanh
dương
(-)
Không có
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm
(-)
Không có Ankaloit Thuốc thử
chung ankaloit
Kết tủa
(-) (+) (+) Có
Coumarin Phát quang trong kiềm
Phát quang
mạnh (-) (-) (-)
Không có
Anthranoid
KOH 10% Dung dịch kiềm có màu
hồng tới đỏ
(+) (+) Có
Flavonoid Mg/HCl đđ Dung dịch có màu hồng tới
đỏ
(-) (+)
Có
Tanin FeCl3 Xanh rêu hay
xanh đen
(-) (-) (-) (-) Không
Saponin Lắc mạnh Tạo bọt bền (-) (-) (+) Có
Axit hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt (+) (+) Có
Chất khử Thuốc thử Fehling
Tủa đỏ gạch (+) (+) Có
Đánh giá theo các mức sau:
(-) Không có () Nghi ngờ (+) Có Ghi chú: Có thể có phản ứng nhưng không thực hiện
Không có mặt các nhóm hợp chất trong dịch chiết
Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của dịch chiết hoàng đằng bằng các phản ứng hóa học nhận thấy trong dược liệu hoàng đằng có chất béo, ankaloit, anthranoid, flavonoid, saponin, axit hữu cơ, chất khử.
3.5. Kết quả xác định thành phần hóa học các hợp chất trong dịch chiết hoàng đằng bằng GC-MS
Kết quả định danh các cấu tử có trong cắn chiết dược liệu hoàng đằng bằng GC-MS được thể hiện ở phổ đồ hình 3.5:
Qua phân tích phổ đồ GC-MS và đối chiếu trong thư viện phổ chuẩn, bước đầu chúng tôi thống kê được một số cấu tử với hàm lượng đáng kể với thời gian lưu và hàm lượng được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần hóa học của cắn chiết hoàng đằng STT tR Hàm
lượng(%)
Định danh KLPT (m/z)
Công thức cấu tạo Hình 3.5. Phổ đồ GC-MS thành phần hóa học các hợp chất trong
dịch chiết hoàng đằng
1 12,154 2,82 Cycloheptasilox ane
tetradecamethyl-
519
Si O O
Si Si O
Si O O
Si
Si O O
Si C
H3 CHH33C CH3
CH3 CH3
C H3 CH3 C
H3H3C C
H3 C H3 C HH33C
2 12,361 1,98 Phenol, 3,5-bis (1,1- dimethylethyl)
206 OH
CH3 C
H3 CH3
CH3CH3 C
H3
3 25,601 13,53 1,2-
benzendicarboxy lic acid, mono (2-ethylhexyl)
este
278
O
CH3
CH3
O OH
O
4 37,757 1,49 Berberine 336
N C O
H3 C O H3
O O
5 37,879 2,51 Palmatine 342
N
OCH3
OCH3 C O
H3 C O H3
Như vậy, trong hỗn hợp cấu tử thu được từ dịch chiết hoàng đằng, có hai ankaloit đó là palmatine chiếm tỉ lệ 2,51% và berberine chiếm tỉ lệ 1,49%. Hai ankaloit này có tác dụng chữa tiêu chảy, lỵ và đặc biệt là ức chế các tụ cầu khuẩn và liên cầu khuẩn.
3.6. Thử hoạt tính kháng sinh cắn chiết thu được từ cây hoàng đằng
Bột hoàng đằng tiến hành chiết Soxhlet với dung môi etanol 960 trong thời gian 8 giờ, dịch chiết thu được có màu vàng đậm. Cô đuổi dung môi thu được cắn chiết.
Gửi mẫu cắn chiết này tới phòng thử hoạt tính sinh học – Viện hóa học Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 3.7
Theo các nghiên cứu trước đây thì các hoạt chất trong hoàng đằng có tác dụng ức chế đối với các tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và liên cầu khuẩn (Streptococcus).
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thử thêm hoạt tính kháng sinh của cắn chiết hoàng đằng với các vi khuẩn Gram (+) như Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, vi khuẩn Gram (-) như Salmonella enterica, Escherichia, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albican thì kết quả cắn chiết hoàng đằng không thể hiện hoạt tính kháng sinh với các chủng vi sinh vật này
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh
Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu hoàng đằng ở xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum như sau:
- Đã giải phẫu thân hoàng đằng và đã xác định được cấu trúc tế bào thân hoàng đằng.
- Hoàng đằng khô có: độ ẩm trung bình là 6,480%; hàm lượng tro là 3,449%, hàm lượng kim loại nặng (Fe: 3,125mg/kg, Hg: 0,025mg/kg, Pb: 0,055mg/kg) phù hợp với TCVN 3572 - 81 và theo Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 4/4/1998.
- Đã tiến hành định tính, định lượng ankaloit trong hoàng đằng với hàm lượng ankaloit là 2,720% và kết quả phù hợp với chuyên luận dược liệu về hoàng đằng theo Dược điển Việt Nam IV.
- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu hoàng đằng với các dung môi khác nhau bằng phản ứng với các thuốc thử: Liebermann-Burchard, thuốc thử chung ankaloit (Mayer, Dragendorff, Bouchardat), Fehling, KOH 10%, Mg/HCl đặc, dung dịch FeCl3, dung dịch HCl, Na2CO3, chúng tôi đã xác định sơ bộ được sự có mặt của chất béo, ankaloit, anthranoid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ, chất khử trong dược liệu hoàng đằng
- Thành phần hóa học trong dịch chiết dược liệu hoàng đằng với dung môi etanol 960 được định danh bằng phương pháp GC-MS, kết quả đã xác định được một số hợp chất như Cycloheptasiloxane tetradecamethyl (2,82%); Phenol 3,5-bis (1,1- dimethylethyl) (1,98%); 1,2benzendicarboxylic acid, mono (2-ethylhexyl) este (13,53%); Berberine (1,49%); Palmatine (2,51%).
- Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của cắn chiết hoàng đằng với các vi khuẩn Gram (+) như Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, vi khuẩn Gram (-) như Salmonella enterica, Escherichia, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albican kết quả cho thấy cắn chiết hoàng đằng không thể hiện hoạt tính kháng sinh với các chủng vi sinh vật này.
2. Kiến nghị
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài chỉ giới hạn trong việc xây dựng tiêu chuẩn của cây hoàng đằng ở xã Sa Bình, huyện Sa Thầy, tỉnh Kon Tum. Trên địa phận lãnh thổ của nước ta, còn rất nhiều vùng với trữ lượng lớn cây hoàng đằng mọc hoang, việc nghiên cứu cần mở rộng đối với các địa bàn này nhằm tận dụng triệt để nguồn dược liệu dồi dào này ở nước ta.
Tiến hành các nghiên cứu, chạy sắc kí cột để phân lập các cấu tử tinh khiết như palmatine, berberin từ hoàng đằng để tìm hiểu hoạt tính sinh học và nghiên cứu các phản ứng chuyển hóa chúng.
TÀILIỆUTHAMKHẢO