a) đại cương về sterol:
Sterol thuộc nhóm Steroid, có nguồn gốc thực vật hoặc ựộng vật. cấu trúc gồm 27 Ờ 29 nguyên tử cacbon trong phân tử. Sterol có sườn cơ bản là:
ciclopentanophenantren
Khung ciclopentanophenantren
Sterol là chất không phân cực, ắt tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi không phân cực như: ete dầu hỏa, benzen, cloroformẦ nên thường dùng các dung môi này ựể ly trắch sterol.
b) Một số thuốc thử dùng ựể nhận biết sterol:
Người ta thường xác ựịnh sự hiện diện của sterol dựa trên phản ứng tạo màu với các thuốc thử sau: Libermann Ờ Burchard, Salkowski, Noller,Ầ
- Thuốc thử Libermann Ờ Burchard: Anhydric axetic 20ml
H2SO4 ựậm ựặc 1ml Nếu thấy xuất hiện màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc ựỏ là phản ứng dương tắnh.
- Thuốc thử Salkowski: H2SO4 ựậm ựặc
Dung dịch tách thành 2 lớp, lớp H2SO4 có màu xanh và lớp cloroform có màu nâu
ựỏ với thuốc thử Salkowski, nếu có sterol.
- Thuốc thử Noller: SOCl2 2ml
Thiếc kim loại 2 viên nhỏ
Cách thử: cho 2ml SOCl2 vào ống nghiệm, sau ựó cho 2 viên nhỏ kim loại
thiếc. Khi dung dịch hết sủi bọt cho tiếp 2ml dung dịch mẫu thử vào. Phản ứng dương tắnh khi dung dịch chuyển từ màu cam sang màu ựỏ tắm.
c) định tắnh sterol:
- Thắ nghiệm: Lấy một ắt cao EtOAc hòa tan trong cloroform, lọc phần dung dịch ựem thử với thuốc thử Salkowski.
- Hiện tượng: dung dịch phân lớp với thuốc thử Salkowski: lớp phắa dưới có màu
nâu ựỏ ựậm, phắa trên có màu nhạt hơn.
- Kết quả: Trong cao EtOAc có sự hiện diện của sterol. 3.1.2.2. Khảo sát sự hiện diện của Tanin:
a) đại cương về Tanin:
Tanin hay axit Tanic là loại hợp chất polyphenol. Tanin thường gặp trong thực vật, có vị chát. Tanin ựược phát hiện dương tắnh với phản ứng thuộc da và ựược ựịnh lượng dựa vào mức ựộ hấp phụ trên bột da sống chuẩn.
Một vài tắnh chất chung của Tanin:
- Làm kết tủa một số protein, ựặc biệt là gelatin, albumin.
- Làm kết tủa một số bazơ hữu cơ, ựặc biệt là kết tủa với một số alkaloid - Tanin tan trong nước và dịch nước có tắnh axit yếu.
Ngoài ra, tanin còn hòa tan trong rượu, axeton, etyl axetat. Tanin không hòa tan
trong ựietyl ete, cloroform, cacbon ựisunfua (CS2), tetraclorua cacbon.
- Tanin thường ở dạng vô ựịnh hình, xốp, có màu vàng nhạt ựến nâu và sậm dần dưới ánh sáng và không khắ.
- Tanin không có nhiệt ựộ nóng chảy xác ựịnh.
b) Một số thuốc thử dùng ựể nhận biết Tanin:
- Dung dịch gelatin mặn: Gelatin 2g
Dung dịch NaCl bão hòa 10ml
Nếu có xuất hiện dạng keo màu vàng nhạt ựể lâu sẽ chuyển thành màu nâu, chứng tỏ có tanin.
- Dung dịch chì axetat (Pb(CH3COO)2) bão hòa.
Nếu có xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt chứng tỏ có Tanin.
- Dung dịch FeCl3 1% trong nước.
Nếu dung dịch chuyển sang màu ựen, chứng tỏ có tanin.
c) định tắnh Tanin:
- Thắ nghiệm: Lấy một ắt cao EtOAc hòa tan bằng dung môi etyl axetat. Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử với chì axetat bão hòa và gelatin mặn.
+ Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2-4 giọt dung dịch chì axetat bão hòa, trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa vàng nhạt, chứng tỏ có tanin.
+ Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm dung dịch gelatin mặn (1ml) xuất hiện dạng keo màu vàng nhạt, ựể một lúc chuyển sang nâu, chứng tỏ có tanin.
- Kết quả: Trong cao EtOAc có sự hiện diện của Tanin. 3.1.2.3. Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid:
a) đại cương về Flavonoid:
Flavonoid là các hợp chất tự nhiên có màu vàng, thường gặp trong thực vật thuộc
nhóm Flavoid có cấu trúc kiểu C6 - C3 - C6.
Khung cơ bản của Flavonoid là:
O
O
Một số Flavonoid tan trong nước, rượu, axit vô cơ loãng và bazơ loãng. Trong dung dịch Flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam, hoặc màu nâu ựỏ với chì axetat, tạo kết
tủa màu xanh lục, ựôi khi màu nâu ựỏ với FeCl3.
b) Một số thuốc thử dùng ựể nhận biết Flavonoid:
Flavonoid ựược xác ựịnh bởi phản ứng Shibata còn gọi là phản ứng Ciandin của Wilstatter. Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch HCl ựậm ựặc, bột Mg kim loại, rượu isoamylic.
Nếu có một vòng màu hồng xuất hiện rồi từ từ chuyển sang màu cam hay ựỏ tắm thì trong dịch thử có chứa Flavonoid.
c) định tắnh Flavonoid:
- Thắ nghiệm: Cho một ắt cao EtOAc, nấu trong 5ml nước trong 10 phút. để nguội, rồi lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Cho dịch vào 2 ống nghiệm:
30
Ống 2: 2ml dịch lọc thêm tiếp 5ml dung dịch HCl ựậm ựặc cho tiếp 0,1g bột Mg rồi thêm từ từ rượu isoamylic vào dọc theo thành ống nghiệm. đun nóng có một vòng màu hồng xuất hiện rồi dần chuyển sang màu ựỏ tắm. Chứng tỏ mẫu thử có chứa Flavonoid.
- Kết quả: Cao EtOAc có chứa Flavonoid. 3.1.2.4. Khảo sát sự hiện diện của Glycosid:
a) đại cương về Glycosid:
Glycosid là hợp chất hữu cơ tạo do sự ngưng tụ giữa một ựường và phần không phải ựường với ựiều kiện nhóm hydroxyl bán axetal của phần ựường tham gia vào sự ngưng tụ. Phần không phải ựường gọi là aglycon hoặc là genin, có cấu trúc hóa học rất khác nhau, ựa số phát hiện sinh học phụ thuộc vào phần này
độ tan khác nhau phụ thuộc mạnh vào mạch ựường dài ngắn và phụ thuộc vào nhóm ái nước có trong phần aglycon. Thường glycosid tan trong nước và etanol loãng, rất ắt tan trong dung môi phân cực (ete, benzenẦ)
b) Một số thuốc thử dùng ựể nhận biết Glycosid:
- Thuốc thử Felling: Dung dịch A: 40gCuSO4.5H2O trong 1 lắt nước cất
Dung dịch B 150g NaOH trong nước cất 50ml glyxerin vào NaOH.
Dùng nước cất dẫn ựến 1 lắt dung dịch
Khi sử dụng trộn 2 dung dịch A và B với thể tắch bằng nhau. Hỗn hợp này cho kết tủa vàng nhạt với dụng dịch có chứa glycosid.
- Thuốc thử Tollen: AgNO3 trong dung dịch NH3 tạo kết tủa khi tiếp xúc dịch etanol
- Thuốc thử Baljet: Dung dịch axit picric 1% 20ml
Dung dịch NaOH 5% 10ml
Nếu có xuất hiện 1 vòng màu vàng dịch chứa glycosid.
- Thuốc thử Molish: Dung dịch thymol 2% 1-2 giọt
H2SO4 ựậm ựặc 1ml
Thuốc thử có màu tắm nhạt, cho dịch etanol vào chuyển sang tắm ựậm hơn. Trong dịch etanol có glycosid.
31
c) định tắnh Glycosid:
- Thắ nghiệm:Cho 1 ắt cao EtOAc hòa tan trong dung dịch etanol 20% lắc mạnh. để
yên qua ựêm. Sau ựó ựem lọc, thêm vào dịch lọc dung dịch chì axetat 10%. Lắc ựều,
ựể yên rồi lọc. Thêm dung dịch Na2SO4 bão hòa vào dung dịch qua lọc ựến không
còn kết tủa nữa. để yên 12 giờ. Lọc, cô cạn dung dịch qua lọc. đem hòa tan phần cặn thu ựược trong etanol. Dung dịch này ựược dùng làm mẫu thử với thuốc thử Felling:
Ống 1: 2ml thuốc thử vào ống nghiệm ựể ựối chứng.
Ống 2: 2ml mẫu thử rồi tiếp tục cho từ từ thuốc thử vào, màu của dung dịch nhạt dần, có xuất hiện kết tủa vàng chứng tỏ trong mẫu thử có chứa glycosid.
- Kết quả: Cao EtOAc có chứa glycosid.
3.2. định tắnh thành phần bột trái mướp ựắng khô:
3.2.1 Khảo sát sự hiện diện các thành phần hợp chất hữu cơ trong bột trái mướp ựắng khô: mướp ựắng khô:
Trên cơ sở ựã nêu về các hợp chất, tiến hành các thắ nghiệm với bột mướp ựắng khô
3.2.1.1. Khảo sát sự hiện của Sterol:
- Thắ nghiệm: Lấy một ắt bột mướp ựắng khô ngâm với cloroform. Lọc phần dung
dịch ựem thử với thuốc thử Salkowski, Libermann Ờ Burchard.
+ Dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang xanh lục nhạt với thuốc thử Libermann Ờ Burchard, chứng tỏ có sterol trong dịch thử.
+ Dung dịch tách 2 lớp với thuốc thử Salkowski, xuất hiện màu nâu ựỏ ở lớp dưới, phắa trên nhạt màu hơn.
- Kết quả: Trong bột mướp ựắng khô có chứa sterol. 3.2.1.2. Khảo sát sự hiện của Tanin:
- Thắ nghiệm: Lấy 5g bột khô thêm vào 100ml nước cất. đun sôi trong 10 phút,
lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử với thuốc thử: chì axetat bão hòa, gelatin mặn, FeCl3.
+ Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch chì axetat bão hòa, có xuất hiện kết
32
+ Lấy 2ml dịch lọc, thêm dung dịch gelatin mặn (1ml), có xuất hiện dạng keo màu vàng nhạt, ựể lâu chuyển nâu, chứng tỏ có tanin.
+ Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 dung dịch chuyển sang màu ựen,
chứng tỏ có tanin.
- Kết quả: Trong bột mướp ựắng khô có chứa tanin. 3.2.1.3. Khảo sát sự hiện của Flavonoid:
- Thắ nghiệm: Cân 5g bột khô ựem nấu trong 100ml nước cất trong 10 phút. để
nguội, rồi lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử. Cho dịch lọc vào hai ống nghiệm: Ống 1: 2ml dịch lọc làm ựối chứng.
Ống 2: 2ml dịch lọc, thêm tiếp 5ml dung dịch HCl ựậm ựặc, cho tiếp 0,1g bột Mg, rồi từ từ rượu isoamylic vào dọc theo thành ống nghiệm. đun nóng, có xuất hiện một vòng màu ựỏ tắm, chứng tỏ trong dịch thử có chứa Flavonoid.
- Kết quả: Trong bột mướp ựắng khô có chứa Flavonoid. 3.2.1.4. Khảo sát sự hiện của Glycosid:
- Thắ nghiệm: Cho 5g bột mướp ựắng khô ngâm trong dung dịch etanol 20% lắc
mạnh. để yên qua ựêm. Sau ựó ựem lọc, thêm vào dịch lọc dung dịch chì axetat
10%. Lắc ựều, ựể yên rồi lọc. Thêm dung dịch Na2SO4 bão hòa vào dung dịch qua
lọc ựến không còn kết tủa nữa. để yên 12 giờ. Lọc, cô cạn dung dịch qua lọc. đem hòa tan phần cặn thu ựược trong etanol. Dung dịch này ựược dùng làm mẫu thử với thuốc thử Felling, Baljet.
+ Với thuốc thử Felling
Ống 1: 2ml thuốc thử vào ống nghiệm ựể ựối chứng.
Ống 2: 2ml mẫu thử rồi tiếp tục cho từ từ thuốc thử vào, màu của dung dịch nhạt dần, có xuất hiện kết tủa vàng chứng tỏ trong mẫu thử có glycosid.
+ Với thuốc thử Baljet:
Ống 1: 2ml thuốc thử vào ống nghiệm ựể ựối chứng.
Ống 2: 2ml dịch etanol rồi tiếp tục cho từ từ thuốc thử vào, có một vòng vàng xuất hiện tức thời, chứng tỏ trong mẫu thử có glycosid.
33
3.2.2. điều chế cao EtOAc từ bột trái mướp ựắng khô:
Sơ ựồ 2: điều chế cao EtOAc
Trái mướp ựắng tươi
Bỏ ruột bên trong Phần trái xanh còn lại
1. Xắt lát 2. Phơi tự nhiên
3. đem sấy ở 500C
Nguyên liệu khô
Xay nhuyễn Bột mướp ựắng khô
1. Ngâm với EtOAc 2. Lọc áp suất thấp
3. Làm khan bằng Na2SO4
Dịch chiết EtOAc
đuổi dung môi Cao EtOAc
- Tiến hành:
Cân 300g trái mướp ựắng tươi ựã bỏ phần ruột bên trong, xắt lát, ựem phơi tự
nhiên rồi sấy ở nhiệt ựộ 500C ựến khối lượng không ựổi ựược nguyên liệu khô. đem
34
áp suất thấp, lấy dịch lọc thu ựược làm khan bằng Na2SO4. Lọc, ựuổi dung môi thu
ựược cao EtOAc. - Ứng dụng sắc kắ:
đối với cao EtOAc, hệ dung môi dùng cho SKLM là PE: EtOAc (1:3), hiện màu
với H2SO4 50%.
Ta thấy có một ựường kéo dài từ ựiểm xuất phát ựến vết cuối, ựồng thời cũng có những vết tròn xen vào ựường kéo dài và ựậm hơn ựường nối dài, nhưng rõ hơn so với cao EtOAc của trái mướp ựắng tươi.
Hình 2.2. SKLM cao EtOAc trong hệ dung môi PE: EtOAc (1:3)
Giá trị Rf của cao EtOAc, hệ dung môi PE: EtOAc (1:3)
Vết Rf 1 2 3 4 0,72 0,34 0,28 0,07
Vậy ta thấy các vết thể hiện trên bảng SKLM có ựường chạy sắc nét hơn và ựẹp hơn khi chạy SKLM của cao EtOAc tươi.
- Tiến hành tách các vết bằng sắc kắ cột:
35
Cột sắc kắ ựược sử dụng là cột thủy tinh có ựường kắnh khoảng 1,7cm, chiều cao của cột khoảng 50cm.
Cân 10g chất hấp phụ Silicagel bột (của hãng Merk) ứng với khoảng 0,5g cao EtOAc.
Chất hấp phụ ựược nhồi vào cột sau ựó ổn ựịnh cột bằng dung môi EtOAc chạy liên tục khoảng 2 giờ. Hòa tan cao EtOAc với một lượng ắt dung môi ựủ ựể hòa tan mẫu. Cho mẫu vào cột. Mở khóa bên dưới cho dung dịch mẫu ngấm vào cột. Khi toàn bộ lớp dung dịch mẫu ựã ngấm vào cột, dùng ống hút lấy một ắt dung môi rửa thành cột. Tiếp theo cho dung môi liên tục ựể bắt ựầu quá trình giải ly.
Quá trình giả ly ựược thực hiện liên tục với dung môi EtOAc và ựược theo dõi bằng SKLM thu ựược 22 lọ.
+ Theo dõi quá trình chạy cột bằng SKLM, hiện màu với H2SO4 50%.
Phân ựoạn Số lọ Hệ dung môi Ghi chú
Phân ựoạn 1 Phân ựoạn 2 Phân ựoạn 3 Phân ựoạn 4 1 - 6 7 - 11 12 - 16 17 - 22 PE 100% PE: EtOAc (1:3) PE: EtOAc (3:1) EtOAc 100% Rf = 0,98 Rf = 0,73 Rf = 0,61 Rf = 0,02
36
Hình ảnh tách các hợp chất hữu cơ không phân cực, phân cực yếu và phân cực như sau:
Hình 2.3. Hình SKLM tách các chất ở các phân ựoạn 1
37
Hình 2.5. Hình SKLM tách các chất ở các phân ựoạn 3
Hình 2.6. Hình SKLM tách các chất ở các phân ựoạn 4
Như vậy, ta dùng sắc kắ cột có thể tách ựược các hợp chất không phân cực, phân cực yếu, phân cực. Mặc dù các hợp chất này thể hiện lên bảng SKLM là các vết kéo dài. Tuy nhiên ở phân ựoạn 2 là thể hiện rõ nhất.
38
PHẦN KẾT LUẬN Ờ đỀ XUẤT 1. Kết luận:
Do nghiên cứu trong thời gian có hạn và một số kĩ thuật thực nghiệm còn hạn chế nên tôi nghiên cứu ựược một số vấn ựề sau ựây:
- Trình bày ựược cơ sở lắ thuyết của ựề tài nghiên cứu.
- Từ trái mướp ựắng (momordica charantina Linn) thuộc họ bầu bắ, tôi ựã thực hiện ựược một số kết quả như sau:
+ Thực hiện việc ựiều chế ựược cao EtOAc từ trái mướp ựắng tươi.
+ định tắnh thành phần một số hợp chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học cho thấy có sự hiện diện của Sterol, Tanin, Flavonoid, Glycosid trong cao EtOAc.
+ định tắnh bằng SKLM trong dịch cao EtOAc của trái mướp ựắng tươi với hệ dung môi PE: EtOAc (1:3).
+ Ngoài ra tôi ựã ựiều chế cao EtOAc từ bột mướp ựắng khô.
+ định tắnh thành phần một số hợp chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học cho thấy có sự hiện diện của Sterol, Tanin, Flavonoid, Glycosid trong bột mướp ựắng khô. + định tắnh bằng SKLM trong cao EtOAc từ bột trái mướp ựắng khô với hệ dung môi PE: EtOAc.
+ Tiến hành tách cột phần cao EtOAc các hợp chất trong bột trái mướp ựắng khô, theo dõi quá trình chạy cột bằng SKLM.
2. đề xuất:
Qua quá trình nghiên cứu và thực nghiệm tôi rút ra một số ựề xuất sau khi nghiên cứu thành phần của trái mướp ựắng:
- Thực hiện với lượng nguyên liệu lớn hơn ựể chiết và tách cột của cao EtOAc ựược nhiều hơn.
- Nghiên cứu bằng một số phương pháp hiện ựại ựể xác ựịnh ựược cấu trúc phân tử các chất.
- Tiếp tục thực hiện tìm dung môi ựể có thể tách ựược các chất ở các phân ựoạn khác nhau trong trái mướp ựắng.
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Võ Văn Chi (1999), Từ ựiển cây thuốc Việt nam, NXB Y Học.
2. Trần Thị đà, Nguyễn Hữu đỉnh (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ
nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo Dục.
3. PGS.TS Lê Thị Anh đào (chủ biên), TS. đặng Văn Liễu, Thực hành hoá học hữu
cơ, NXB đại học sư phạm.
4. Lê Văn đăng (2005), Chuyên ựề một số hợp chất thiên nhiên, NXB đại học quốc
gia Thành phố Hồ Chắ Minh.
5. Hồ Viết Quý (2001) , Giáo trình phân tắch lắ Ờ hóa, NXB Giáo Dục, Hải Dương
6. Võ Hồng Thái, Khảo sát thành phần Triterpen Glycosid trong hạt mướp ựắng,