5. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Cách bố trí thí nghiệm.
* Nhóm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm gồm:
- Thí nghiệm thăm dò nồng độ: ƣơm hạt trong điều kiện bình thƣờng và trong các nồng độ đƣờng 0,2M; 0,3M; 0,4M; 0,5M. Chọn để nghiên cứu ở nồng độ hạt vẫn nảy mầm nhƣng kém hơn hẳn so với hạt ở điều kiện bình thƣờng.
- Thí nghiệm xác định các chỉ tiêu giai đoạn nảy mầm: tiến hành ƣơm mầm chia làm 2 lô (mỗi lô 3 khay): lô đối chứng (nảy mầm trong nƣớc cất) và lô thí nghiệm (nảy mầm trong dung dịch gây hạn).
* Nhóm thí nghiệm trong nhà lƣới:
- Tiến hành trồng cây trong nhà lƣới chia làm 2 lô là lô đối chứng (trồng cây trong đất không gây hạn) và lô thí nghiệm (trồng cây trong đất và gây hạn). Mỗi lô tiến hành gieo trong 10 - 15 chậu, mỗi chậu gieo 3-4 hạt đến lúc trƣớc khi ra hoa thì chỉ để lại mỗi chậu 1 cây.
+ Giai đoạn cây non: khi cây đƣợc 4 lá thật gây hạn bằng cách không tƣới nƣớc liên tục đến lúc héo 2 lá thật dƣới cùng thì xác định các chỉ tiêu (lấy mẫu xác định là là thứ 2 tính từ trên ngọn xuống).
+ Giai đoạn ra hoa: khi cây bắt đầu ra nụ hoa thì không tƣới nƣớc ở lô thí nghiệm đến khi héo 2 lá dƣới cùng thì xác định các chỉ tiêu (lấy mẫu xác định là lá thứ 3 tính từ trên ngọn xuống).
+ Giai đoạn tạo quả: cũng gây hạn và lấy mẫu xác định nhƣ giai đoạn ra hoa khi cây bắt đầu hình thành quả.
2.3.2. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu.
Giai đoạn nảy mầm:
Xác định các chỉ tiêu ở ngày thứ 2, 4, 6, 8 sau khi ƣơm.
Giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả
Xác định các chỉ tiêu lúc cây hình thành 4 lá thật, bắt đầu ra nụ và bắt đầu tạo quả.
Cách xác định các chỉ tiêu:
- Hàm lượng acid amine proline:
Xác định hàm lƣợng acid amine proline theo phƣơng pháp so màu của Bates và cộng sự (1973) [27] [41]:
Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch acid sufosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút, lấy dịch chiết.
Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml acid acetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nƣớc nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ đá 5 phút.
Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem so màu ở bƣớc sóng λ = 520nm bằng máy UV 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản sản xuất.
Công thức suy ra từ việc lập đƣờng chuẩn proline: pha proline tinh khiết theo các nồng độ 20µg/ml, 40µg/ml, 60µg/ml, 80µg/ml, 100 µg/ml, tiến hành phản ứng theo quy trình đã trình bày ở trên rồi đo độ hấp thụ bƣớc sóng 520nm trên máy UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản). Sau đó dựng đƣờng chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
Hàm lƣợng proline đƣợc đổi ra µg/g theo công thức:
(Trong đó: A: hàm lƣợng proline (µg/g); X: nồng độ proline (µg/ml) tƣơng ứng với giá trị OD; V: thể tích dịch chiết (ml); df: hệ số pha loãng (trong trƣờng hợp này là 5); w: khối lƣợng mẫu).
- Hàm lượng đường khử:
Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp vi phân tích (theo Phạm Thị Trân Châu) [2] [27]:
Lấy 1g mẫu nghiền kĩ trong 10ml nƣớc cất, ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết phía trên.
Lấy 2ml dịch chiết và 2ml kaliferixianua vào ống nghiệm khuấy đều, đun sôi trong 15 phút, vừa đun vừa khuấy, sau đó để nguội rồi thêm vào 4ml dung dịch sắt sunfat acid gelatin, khuấy đều, dẫn nƣớc đến 20ml.
So màu dung dịch trên máy so màu UV - 2450, với bƣớc sóng 585nm. Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc tính theo công thức suy ra từ việc lập đƣờng chuẩn đƣờng khử: lấy 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5, cho vào từng ống khối lƣợng đƣờng tƣơng ứng: 10, 20, 30, 40, 50mg trong 2ml dung dịch rồi tiến hành tƣơng tự nhƣ ống thí nghiệm và so màu xác định OD trên máy so màu UV - 2450 với bƣớc sóng 585nm. Sau đó dựng đƣờng chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
A = Y
P .V
Trong đó: A là hàm lƣợng đƣờng khử (µg/g); Y là nồng độ đƣờng khử (µg/ml) tƣơng ứng với giá trị OD; P là khối lƣợng mẫu nghiên cứu (g); V là thể tích dịch chiết (ml)
- Hàm lượng glycine betaine:
Xác định theo phƣơng pháp của Grieve và Grattan (1983) [26]:
Lấy 0,5g mẫu nghiền nhỏ hòa trong 20ml nƣớc cất đặt vào máy lắc trong 24h ở 250C rồi lấy dịch lọc.
Pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỷ lệ 1:1.
Lấy 0,5ml dịch sau pha loãng cho vào ống eppendorf 2ml, đặt vào hộp đá trong 60 phút.
Sau đó bổ sung 0,2ml dung dịch kali tri-iot, đặt hỗn hợp phản ứng này ở 0 - 40
C trong 16h rồi ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở 00C.
Hút phần dịch nổi cho vào ống nghiệm, bổ sung 9ml 1,2-diclometan (đã làm mát ở -100C), đảo đều trong khoảng 1 - 2 phút (luôn giữ hỗn hợp này ở 40
C).
Sau 2 - 2,5h, bỏ lớp nƣớc phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dƣới ở bƣớc sóng 365nm.
Hàm lƣợng glycine betaine đƣợc tính toán từ đƣờng chuẩn:
Y = 0,865X - 0,348 (R2 = 0,97) (trong đó: Y là nồng độ glycine betaine (µg/ml); X là giá trị OD tƣơng ứng).
Đƣờng chuẩn này đã đƣợc công bố trong sách “phƣơng pháp nghiên cứu sinh học thực vật” đƣợc tác giả cũng xây dựng trên máy so màu UV – 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản tại Trung tâm Hỗ trợ và chuyển giao công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội II .
Trong đó: Glycine beetain (mg/g); V là thể tích dịch chiết (ml); df là hệ số pha loãng (trong trƣờng hợp này là 80); w là khối lƣợng mẫu (g).
2.3.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu.
Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel theo các tham số: giá trị trung bình ( ), độ lệch chuẩn (δ), sai số trung bình (m), Hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (md), độ chính xác của thí nghiệm (m%) đƣợc tính theo công thức sau:
N i i=1 X X= n 2 i X -X δ= n-1 δ m=± n δ.100 Cv=± X 0 0 δ m = X md = m m2 2 2 1 Trong đó: Xi: là giá trị đo đƣợc qua mỗi lần đo; n: là số lần nhắc lại.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thăm dò nồng độ đƣờng
Sau khi làm thí nghiệm thăm dò nồng độ đƣờng ở các nồng độ 0,2M; 0,3M; 0,4M và 0,5M chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.1 và hình 3.1:
Bảng 3.1. Tỷ lệ nảy mầm ở thí nghiệm thăm dò nồng độ
Nồng độ Nƣớc cất 0,2M 0,3M 0,4M 0,5M
Tỷ lệ nảy mầm (%) 100 100 98,89 92,22 72,22
Hình 3.1. Tỷ lệ nảy mầm ở thí nghiệm thăm dò nồng độ
Từ bảng 3.1 và hình 3.1 ở trên chúng tôi nhận thấy rằng ở nồng độ đƣờng 0,2M và 0,3M tỷ lệ nảy mầm của lạc không khác mấy so với gieo hạt ở nƣớc cất. Còn ở nồng độ đƣờng 0,5M thì tỷ lệ nảy mầm của hạt lạc khá thấp so với tỷ lệ nảy mầm của hạt lạc ở nƣớc cất. Vì vậy, tôi chọn nghiên cứu hạt nảy mầm ở nồng độ đƣờng 0,4M với tỉ lệ nảy mầm hơi thấp hơn so với hạt
gieo ở nƣớc cất. Thêm nữa, ở nồng độ đƣờng 0,4M thì tốc độ sinh trƣởng của mầm lạc kém hơn hẳn so với mầm lạc ở nƣớc cất, còn ở nồng độ đƣờng 0,2M và 0,3M thì tốc độ sinh trƣởng của mầm lạc tƣơng đƣơng với mầm lạc ở nƣớc cất.
3.2. Ảnh hƣởng của khô hạn đến sự hình thành proline
* Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn proline đƣợc thể hiện theo bảng a và hình a nhƣ sau: Bảng a. Nồng độ proline và giá trị OD Nồng độ (µg/ml) OD 20 0.45 40 0.81 60 1.17 80 1.52 100 1.88
Hình a. Biểu đồ biểu diễn đƣờng chuẩn proline
Trong đó: X - nồng độ proline (µg/ml); Y – giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ X
3.2.1. Ảnh hƣởng của khô hạn đến sự hình thành proline ở giai đoạn nảy mầm đoạn nảy mầm
Proline là một acid amine có khả năng hòa tan mạnh trong nƣớc, giữ nƣớc, lấy nƣớc và điều hòa áp suất thẩm thấu cho tế bào. Proline đóng vai trò then chốt trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào chất thực vật để phản ứng lại với điều kiện môi trƣờng bất lợi. Đo đó, định lƣợng proline có thể đánh giá vai trò bảo vệ tế bào của proline khi ở trong các điều kiện môi trƣờng bất lợi.
Hàm lƣợng proline qua các ngày trong giai đoạn nảy mầm của lạc đƣợc thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2 nhƣ sau:
Bảng 3.2: Hàm lƣợng proline trong mầm lạc
Ngày Hàm lƣợng proline (µg/g) % so với đối chứng ĐC TN Ngày thứ 2 0,541 ± 0,031 0,919 ± 0,055 170 Ngày thứ 4 0,644 ± 0,022 1,215 ± 0,089 189 Ngày thứ 6 0,735 ± 0,039* 1,520 ± 0,022 207 Ngày thứ 8 0,696 ± 0,032* 1,642 ± 0,063 236
Dấu * thể hiện sự sai khác giữa các giá trị với mức ý nghĩa > 95% không có ý nghĩa
Từ bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy hàm lƣợng proline giai đoạn nảy mầm có sự khác nhau rõ rệt giữa lô đối chứng không gây hạn và lô thí nghiệm gây hạn qua các ngày.
Hàm lƣợng proline ở lô thí nghiệm cao hơn hẳn so với lô đối chứng ở tất cả các ngày. Cụ thể là hàm lƣợng proline ở lô thí nghiệm cao gấp 170% ở ngày thứ 2 sau khi gieo, gấp 189% ở ngày thứ 4 sau khi gieo, 207% ở ngày thứ 6 sau khi gieo, 236% ở ngày thứ 8 sau khi gieo so với lô đối chứng ở điều kiện đủ nƣớc.
Hàm lƣợng proline ở lô thí nghiệm tăng dần qua các ngày trong đó tăng rõ rệt từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6 sau khi gieo (ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 sau khi gieo và từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6 sau khi gieo đều tăng gần 0,3µg/g), còn từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8 sau khi gieo tăng không đáng kể (tăng 0,12µg/g). Đối với lô đối chứng, hàm lƣợng proline cũng tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6 sau khi gieo (4 ngày tăng gần 0,2µg/g) nhƣng từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 8 sau khi gieo thì lại giảm một lƣợng nhỏ không đáng kể (2 ngày giảm 0,04µg/g).
Trong thời gian nảy mầm của hạt lạc khi bị hạn đã làm tăng hàm lƣợng proline trong mẫu để giúp cho mầm chống chịu với điều kiện thiếu nƣớc. Điều này cũng giống với một số các cây trồng khác mà các tác giả khác đã nhận đƣợc nhƣ: tác giả Đinh Thị Phòng (2001) nghiên cứu về proline ở lúa đã khẳng định hàm lƣợng proline tăng lên theo thời gian từ 4 đến 8 ngày gây hạn bằng cách đƣa 70g/l sorbitol vào dung dịch nuôi ở giai đoạn mạ 3 lá trong các dòng tái sinh từ tế bào chịu mất nƣớc [28]; một số nghiên cứu trên đối tƣợng ngô và đậu tƣơng của Nguyễn Văn Mã và cộng sự trong giai đoạn nảy mầm cũng cho thấy hàm lƣợng proline tăng lên dần theo các ngày khi gây hạn bằng áp suất thẩm thấu [28], [32].
3.2.2. Ảnh hƣởng của khô hạn đến sự hình thành proline ở lá các giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả đoạn cây non, ra hoa và tạo quả
Để làm sáng tỏ hơn sự hình thành proline, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu proline ở lá giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả.
Kết quả xác định hàm lƣợng proline trong lá cây lạc ở các giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả thu đƣợc ở bảng 3.3 và hình 3.3:
Bảng 3.3: Hàm lƣợng proline trong lá cây lạc giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả. Giai đoạn Hàm lƣợng prolin ở lá (µg/g) % so với ĐC TN đối chứng Cây non 1,159 ± 0,023 1,945 ± 0,047 168 Ra hoa 1,273 ± 0,167 2,824 ± 0,005 222 Tạo quả 1,047 ± 0,256 2,128 ± 0,139 203
Hình 3.3: Hàm lƣợng proline trong lá cây lạc giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả
Từ kết quả số liệu ở bảng 3.2 và hình 3.2, chúng ta thấy hàm lƣợng proline ở lô thí nghiệm bị gây hạn cao hơn hẳn so với lô đối chứng đủ nƣớc ở tất cả các giai đoạn. Trong đó, giai đoạn ra hoa có sự chênh lệch là lớn nhất (thí nghiệm cao gấp 222%) và giai đoạn cây non chênh lệch nhỏ nhất (thí nghiệm cao gấp 168%), còn giai đoạn tạo quả lô thí nghiệm cao gấp 203% lô đối chứng.
Ở cả lô đối chứng và lô thí nghiệm hàm lƣợng proline đều cao nhất ở giai đoạn ra hoa và thấp hơn ở giai đoạn cây non, tạo quả nhƣng ở lô thí nghiệm sự tăng giảm hàm lƣợng proline giữa các giai đoạn rõ rệt hơn ở lô đối chứng. Cụ thể, ở lô thí nghiệm giai đoạn ra hoa cao hơn giai đoạn cây non gần 0,9µg/g, cao hơn giai đoạn tạo quả gần 0,7µg/g. Còn ở lô đối chứng, hàm lƣợng proline ở giai đoạn ra hoa cao hơn hai giai đoạn còn lại không đáng kể, giai đoạn ra hoa chỉ cao hơn giai đoạn cây non và tạo quả lần lƣợt là hơn 0,1µg/g và hơn 0,2µg/g .
Có lẽ, giai đoạn ra hoa là giai đoạn mẫn cảm với điều kiện thiếu nƣớc nhất vì đây là giai đoạn chuyển từ sinh trƣởng sinh dƣỡng sang sinh trƣởng sinh thực. Hơn nữa, proline còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trồng mặc dù proline không phải là một trong những acid amine không thay thế. Sự tích lũy proline đƣợc xác nhận ở các loại mô và cơ quan sinh sản của khá nhiều loài cây, bởi vậy proline còn có vai trò trong quá trình phát triển các loại cơ quan sinh sản ở thực vật. Hai quá trình phát triển đã đƣợc chứng minh đó là proline tham gia vào quá trình kéo dài cuống hoa và thời gian nở hoa [60].
Proline là một chỉ số thuận với sự tăng ấp suất thẩm thấu của tế bào. Sự gia tăng hàm lƣợng proline trong điều kiện hạn nhân tạo có ý nghĩa rất lớn trong việc duy trì khả năng hút nƣớc và giữ nƣớc của cây tạo điều kiện cho cây có hoạt động sống bình thƣờng [39], [53]. Điều này chứng tỏ lạc cóphản
ứng thích nghi với điều kiện thiếu nƣớc của môi trƣờng. Ở thực vật khi bị tác động của áp suất thẩm thấu cao thì sự tích lũy proline có thể tăng từ 10 – 100 lần. Theo báo cáo của Kihor và cộng sự (1995), sự tổng hợp proline tăng từ 10 – 18 lần ở cây thuốc lá đƣợc chuyển gen P5CS (gen mã hóa tổng hợp emzyme pyroline – 5 cacboxylate synthase là emzyme đầu tiên cho chu trình tổng hợp proline) so với cây đối chứng không đƣợc chuyển gen P5CS [54]. Các tác giả khác khi nghiên cứu trong điều kiện stress nƣớc ở một số loài thực vật nhƣ đậu tƣơng [9], đậu xanh [48] , lúa [53], mía [13], khoai tây, cà chua cũng cho kết quả tƣơng tự là đều có sự gia tăng tổng hợp proline ở lá.
Để đánh giá khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và lạc nói riêng, cần dựa vào nhiều chỉ tiêu nhƣng có thể coi proline là chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật, hay sự tích lũy proline biểu hiện phản ứng thích nghi của thực vật khi gặp hạn. Nhƣ vậy, có thể thấy proline hình thành với hàm lƣợng khá cao trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao để tăng khả năng bảo vệ cho tế bào.
3.3. Ảnh hƣởng của khô hạn đến sự hình thành đƣờng khử
* Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn đƣờng khử đƣợc thể hiện theo bảng b và hình b nhƣ sau: Bảng b. Nồng độ đƣờng khử và giá trị OD Nồng độ (µg/ml) OD 20 1,46 40 1,63 60 1,81 80 1,98 100 2,26
Hình b. Biểu đồ biểu diễn đƣờng chuẩn đƣờng khử
Trong đó: X - nồng độ đƣờng khử (µg/ml); Y - giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ X
3.3.1. Ảnh hƣởng của khô hạn đến sự hình thành đƣờng khử ở giai đoạn nảy mầm