5. Ý nghĩa lí luận và thực tiễn
2.3.2.Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Giai đoạn nảy mầm:
Xác định các chỉ tiêu ở ngày thứ 2, 4, 6, 8 sau khi ƣơm.
Giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả
Xác định các chỉ tiêu lúc cây hình thành 4 lá thật, bắt đầu ra nụ và bắt đầu tạo quả.
Cách xác định các chỉ tiêu:
- Hàm lượng acid amine proline:
Xác định hàm lƣợng acid amine proline theo phƣơng pháp so màu của Bates và cộng sự (1973) [27] [41]:
Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch acid sufosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút, lấy dịch chiết.
Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml acid acetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nƣớc nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ đá 5 phút.
Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem so màu ở bƣớc sóng λ = 520nm bằng máy UV 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản sản xuất.
Công thức suy ra từ việc lập đƣờng chuẩn proline: pha proline tinh khiết theo các nồng độ 20µg/ml, 40µg/ml, 60µg/ml, 80µg/ml, 100 µg/ml, tiến hành phản ứng theo quy trình đã trình bày ở trên rồi đo độ hấp thụ bƣớc sóng 520nm trên máy UV-Vis 2450 (Shimadzu, Nhật Bản). Sau đó dựng đƣờng chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
Hàm lƣợng proline đƣợc đổi ra µg/g theo công thức:
(Trong đó: A: hàm lƣợng proline (µg/g); X: nồng độ proline (µg/ml) tƣơng ứng với giá trị OD; V: thể tích dịch chiết (ml); df: hệ số pha loãng (trong trƣờng hợp này là 5); w: khối lƣợng mẫu).
- Hàm lượng đường khử:
Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp vi phân tích (theo Phạm Thị Trân Châu) [2] [27]:
Lấy 1g mẫu nghiền kĩ trong 10ml nƣớc cất, ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết phía trên.
Lấy 2ml dịch chiết và 2ml kaliferixianua vào ống nghiệm khuấy đều, đun sôi trong 15 phút, vừa đun vừa khuấy, sau đó để nguội rồi thêm vào 4ml dung dịch sắt sunfat acid gelatin, khuấy đều, dẫn nƣớc đến 20ml.
So màu dung dịch trên máy so màu UV - 2450, với bƣớc sóng 585nm. Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc tính theo công thức suy ra từ việc lập đƣờng chuẩn đƣờng khử: lấy 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5, cho vào từng ống khối lƣợng đƣờng tƣơng ứng: 10, 20, 30, 40, 50mg trong 2ml dung dịch rồi tiến hành tƣơng tự nhƣ ống thí nghiệm và so màu xác định OD trên máy so màu UV - 2450 với bƣớc sóng 585nm. Sau đó dựng đƣờng chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
A = Y
P .V
Trong đó: A là hàm lƣợng đƣờng khử (µg/g); Y là nồng độ đƣờng khử (µg/ml) tƣơng ứng với giá trị OD; P là khối lƣợng mẫu nghiên cứu (g); V là thể tích dịch chiết (ml)
- Hàm lượng glycine betaine:
Xác định theo phƣơng pháp của Grieve và Grattan (1983) [26]:
Lấy 0,5g mẫu nghiền nhỏ hòa trong 20ml nƣớc cất đặt vào máy lắc trong 24h ở 250C rồi lấy dịch lọc.
Pha loãng dịch lọc bằng H2SO4 2N với tỷ lệ 1:1.
Lấy 0,5ml dịch sau pha loãng cho vào ống eppendorf 2ml, đặt vào hộp đá trong 60 phút.
Sau đó bổ sung 0,2ml dung dịch kali tri-iot, đặt hỗn hợp phản ứng này ở 0 - 40
C trong 16h rồi ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở 00C.
Hút phần dịch nổi cho vào ống nghiệm, bổ sung 9ml 1,2-diclometan (đã làm mát ở -100C), đảo đều trong khoảng 1 - 2 phút (luôn giữ hỗn hợp này ở 40
C).
Sau 2 - 2,5h, bỏ lớp nƣớc phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dƣới ở bƣớc sóng 365nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lƣợng glycine betaine đƣợc tính toán từ đƣờng chuẩn:
Y = 0,865X - 0,348 (R2 = 0,97) (trong đó: Y là nồng độ glycine betaine (µg/ml); X là giá trị OD tƣơng ứng).
Đƣờng chuẩn này đã đƣợc công bố trong sách “phƣơng pháp nghiên cứu sinh học thực vật” đƣợc tác giả cũng xây dựng trên máy so màu UV – 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản tại Trung tâm Hỗ trợ và chuyển giao công nghệ - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội II .
Trong đó: Glycine beetain (mg/g); V là thể tích dịch chiết (ml); df là hệ số pha loãng (trong trƣờng hợp này là 80); w là khối lƣợng mẫu (g).