6. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
2.2.3.Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
* Xác định huỳnh quang diệp lục
Phƣơng tiện: sử dụng máy đo huỳnh quang diệp lục Chlorophyll fluorometer OS- 30 do hãng ADC sản xuất.
Cách tiến hành: trong giai đoạn cây con tiến hành đo ở lá thứ 4 từ dƣới lên, còn giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa tiến hành đo ở lá thứ 8 từ dƣới lên.
Thời gian đo: thƣờng đo vào 8 giờ – 9 giờ sáng, lúc có ánh sáng vừa phải, đo các mẫu thí nghiệm đã gây hạn và mẫu đối chứng.
Các thông số đo đƣợc: huỳnh quang ổn định (F0 ), huỳnh quang cực đại (Fm), huỳnh quang biến đổi (Fvm).
Cách đo đƣợc tiến hành theo các bƣớc:
Bước 1: chọn mẫu đo, lau sạch và khô mẫu (không đƣợc để tổn thƣơng mẫu). Sau đó dùng kẹp phân tích kẹp mẫu (phải đóng “cửa chớp” của kẹp lại). Thời gian kẹp tuỳ thuộc từng loại mẫu, dao động từ 5 – 15 phút.
Bước 2: khi mẫu kẹp đƣợc mở bằng cách bật nút mở nguồn ở bên trái thân máy, ấn Mode màn hình sẽ xuất hiện các thông số mà máy đo đƣợc.
Bước 3: mẫu đo đủ thời gian ủ tối, ta đƣa đầu đo vào kẹp rồi rút “cửa chớp” của kẹp ra. Đo mẫu bằng cách ấn nút Moden trên thân máy hoặc ấn nút trên đầu đo, kết quả đo đƣợc hiển thị trên màn hình [15] .
* Xác định cƣờng độ quang hợp (bằng cách xác định cƣờng độ hấp thụ CO2).
Phƣơng tiện: sử dụng thiết bị PPSYSTEM TPS – 2 (Mỹ, 2011) phân tích hàm lƣợng CO2 của cây trồng hấp thụ dựa trên phƣơng pháp phát hiện bằng detector hồng ngoại.
Cách tiến hành: trong giai đoạn cây con, chọn các lá thứ 4 từ dƣới lên lên, sau đó lau sạch lá, kẹp buồng lá cần đo theo đúng kỹ thuật, chờ thông số CO2 ổn định thì ghi kết quả. Trong giai đoạn sắp ra hoa tiến hành đo ở lá thứ 8 từ dƣới lên.
Thời gian đo: thƣờng đo vào 8 giờ – 9 giờ sáng lúc có ánh sáng vừa phải, đo các mẫu thí nghiệm đã gây hạn và mẫu thí nghiệm đối chứng, đơn vị tính cƣờng độ quang hợp là µmol CO2.m-2.s-1 [15].
Cách đo đƣợc tiến hành theo các bƣớc:
Bước 1: kết nối đầu dò thu tín hiệu vào chân PLC, kết nối đầu khí vào của đầu dò (ký hiệu là A trên đầu dò) vào cổng PCL A trên máy đo. Kết nối đầu khí ra của đầu dò (ký hiệu là R trên đầu dò) vào cổng PCL R trên máy đo.
Bước 2: bật đầu máy đo trên màn hình, vào khởi động, sau đó hiện ra màn hình chính các lựa chọn tƣơng ứng các phím chọn từ 1 – 6.
Bước 3 (thiết lập phép đo và tiến hành phép đo):
- Ấn phím 1 trên màn hình chính để chọn chế độ REC, màn hình sẽ xuất hiện Menu 1, nhấn nút 1 trong Menu để sử dụng đầu dò PLC4. Sau khi chọn xong, đầu đo máy sẽ xuất hiện ra Menu 2 để chọn chế độ đo (tự động hay bằng tay), để thiết lập khoảng thời gian ghi số liệu.
- Nhấn nút Y để chuyển sang chọn nguồn sáng và thiết lập diện tích lá. Sau khi chọn xong nguồn sáng và thiết lập diện tích lá ta nhấn tiếp nút Y để chọn ô nhớ. Sau khi chọn xong ô nhớ, ấn tiếp nút Y để chuyển sang chế độ đo. Máy sẽ tự động Warmup. Sau khi Warmup xong máy sẽ chuyển sang chế độ đo [15].
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu đƣợc tổng hợp và xử lý số liệu theo phƣơng pháp thống kê toán học qua các thông số: trung bình số học (X ), độ lệch chuẩn (δ) sai số trung bình (m), hệ số biến động (CV). Độ chính xác của thí nghiệm (m%), tiêu chuẩn độ tin của hiệu (td). Các thông số đƣợc so trong bảng phân phối Student với số bậc tự do (n1+n2 -2) với mức ý nghĩa α= 0,05.
1 N i i X X n , 2 1 i X X n , .100 CV X , m n % m X , dXDCXTN , d d d t m
Trong đó: XDC: trung bình đối chứng XTN: trung bình thí nghiệm m1: sai số mẫu đối chứng m2: sai số mẫu thí nghiệm
Các tính toán đƣợc thực hiện trên cơ sở sử dụng những ứng dụng của phần mềm Microsoft Excel 2010. Trong mỗi bảng số liệu, số liệu so sánh giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng kèm theo dấu * thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy α = 0,05.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Động thái huỳnh quang diệp lục của lá ngô trong quá trình bị khô hạn
Xác định huỳnh quang diệp lục là phƣơng pháp nghiên cứu không cần phá vỡ tế bào để khảo sát nhanh trạng thái sinh lí của cây và xác định mức độ cảm ứng của thực vật với tác động bất lợi từ môi trƣờng. Các yếu tố môi trƣờng, đặc biệt là các yếu tố môi trƣờng bất lợi có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến tốc độ quá trình quang hợp và trạng thái bộ máy quang hợp, tốc độ chuyển hóa năng lƣợng ánh sáng. Những biến đổi tức thời này có thể xác định và đƣợc thể hiện bằng hình ảnh qua phƣơng pháp đo huỳnh quanh diệp lục invivo [8], [26], [36].
3.1.1. Động thái huỳnh quang diệp lục của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con ở giai đoạn cây con
Giai đoạn cây con là giai đoạn thƣờng bắt đầu khi ngô đạt 3 – 4 lá, giai đoạn này cây chuyển từ trạng thái sống nhờ chất dự trữ trong hạt sang trạng thái hút chất dinh dƣỡng của đất. Có thể nói đây là giai đoạn cây ngô rất mẫn cảm với nƣớc.
3.1.1.1. Động thái huỳnh quang ổn định của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con giai đoạn cây con
Kết quả thí nghiệm về huỳnh quang ổn định của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Động thái huỳnh quang ổn định của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con
Quá trình thí nghiệm
Huỳnh quang ổn định (Fo)
Đối chứng Thí nghiệm % Đối
chứng
Giai đoạn gây hạn (ngày) 1 336,6 ± 3,3 337,3 ± 3,8 100 2 349,3 ± 5,5 352,2 ± 8,5 101 3 363,2 ± 5,8 370,5 ± 6,9 102 4 359,6 ± 7,0 379,2 ± 8,4 106* 5 355,2 ± 6,8 395,1 ± 8,7 111* 6 368,7 ± 5,2 412,6 ± 7,0 112* 7 361,7 ± 6,1 434,7 ± 7,9 120* Giai đoạn phục hồi (ngày) 8 371,6 ± 8,8 427,9 ± 5,6 115* 9 385,1± 6,2 420,6 ± 9,5 109* 10 372,3 ± 5,0 399,2 ± 8,0 107* 11 346,1 ± 7,3 356,7 ± 5,4 103 12 354,8 ± 4,5 374,1 ± 5,9 105* 13 342,6 ± 4,8 331,2 ± 7,5 97 14 339,1 ± 5,2 334,5 ± 3,8 99
Ghi chú: Dấu * chỉ sự sai khác giữa thí nghiệm và đối chứng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy trên 95%
Huỳnh quang ổn định (F0) là sự bức xạ đƣợc diệp lục phát ra với bƣớc sóng dài hơn bƣớc sóng hấp thụ đồng thời với thời gian chiếu sáng. Sự biến động của huỳnh quang ổn định phần nào phản ánh khả năng chịu hạn của cây trồng.
Hình 3.1. Động thái huỳnh quang ổn định của cây ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con
Từ kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, trong điều kiện đủ nƣớc, huỳnh quang ổn định của lô đối chứng khá ổn định. Đối với lô thí nghiệm trong điều kiện thiếu nƣớc 3 ngày, huỳnh quang ổn định chƣa biến động rõ rệt, điều này thể hiện qua tỉ lệ % giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng của ngày thứ nhất, thứ hai và thứ ba lần lƣợt là 100%, 101%, 102%. Chứng tỏ trong điều kiện thiếu nƣớc 3 ngày, các trung tâm phản ứng P680 và P700 vẫn hoạt động ổn định, năng lƣợng dùng cho các phản ứng quang hóa đƣợc đảm bảo. Đến ngày gây hạn thứ 4, giá trị huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm bắt đầu tăng, tỉ lệ so với lô đối chứng là 106%, chứng tỏ sự thiếu nƣớc đã bắt đầu ảnh hƣởng đến bộ máy quang hợp. Sang đến ngày thứ 5, huỳnh quang ổn định có tỉ lệ % giữa thí nghiệm và lô đối chứng là 111%, so với ngày thứ 4 tỉ lệ chênh lệch giữa thí nghiệm và lô đối chứng tăng lên 5%. Chứng tỏ cấu trúc lục lạp bị hƣ hại, hoạt tính thủy phân của enzym Chlorophylaze tăng lên, diệp lục bị phân giải, sự tổng hợp của diệp lục a và b bị ức chế, do đó làm giảm
dần năng lƣợng chuyển đến trung tâm phản ứng. Sang đến ngày thứ 6, huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm tăng chậm lại và tỉ lệ giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng là 112%, nhƣ vậy sự chênh lệch giữa lô thí nghiệm và đối chứng chỉ tăng 1% so với ngày thứ 5. Hiện tƣợng này có thể giải thích nhƣ sau: khi xảy ra quá trình khô hạn ở thực vật nói chung và ở cây ngô nói riêng, đã tự hình thành khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, do đó lƣợng nƣớc đƣợc giữ lại trong cây, làm cho hàm lƣợng diệp lục đƣợc phục hồi, dẫn đến năng lƣợng ánh sáng dùng cho quá trình quang hóa tăng lên. Đến ngày gây hạn thứ 7, huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm tiếp tục tăng, tỉ lệ so với lô đối chứng là 120%. So với ngày thứ 6, tỉ lệ chênh lệch giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng tăng lên 8% và đạt giá trị cao nhất là 434,7. Nhƣ vậy sau 7 ngày gây hạn, huỳnh quang ổn định tăng dần theo thời gian gây hạn và tăng nhanh nhất vào ngày cuối cùng. Kết quả nghiên cứu này có thể giải thích, trong điều kiện thiếu nƣớc trầm trọng đã gây tổn thƣơng bộ máy quang hợp, cụ thể là các protein, số lƣợng các trung tâm phản ứng ở trạng thái “mở ” giảm đi, đồng thời năng lƣợng kích thích bị mất đi khi vận chuyển về trung tâm phản ứng PS II, dẫn đến năng lƣợng dùng cho quang hóa giảm, kết quả là huỳnh quang ổn định tăng trong điều kiện gây hạn. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của hạn đến huỳnh quang ổn định ở lúa [21], đậu tƣơng [7], vừng [9], cũng cho thấy huỳnh quang ổn định tăng trong điều kiện tƣới nƣớc không đầy đủ.
Khi bắt đầu đƣợc tƣới nƣớc trở lại, huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm giảm xuống, tỉ lệ so với lô đối chứng là 115%. Nhƣ vậy, sự chênh lệch giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng giảm 5% so với ngày thứ 7. Hiện tƣợng này phản ánh năng lƣợng trong quá trình chuyển về trung tâm phản ứng PS II đã tăng dần. Đến ngày thứ 9, sự chênh lệch giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng là 109%. Nhƣ vậy khi tăng thời gian tƣới nƣớc trong giai đoạn phục hồi, số lƣợng trung tâm phản ứng P680 ở trạng thái “mở ” tăng dần, đồng nghĩa
với huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm giảm. Sang đến ngày thứ 10, mức độ huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm giảm với tỉ lệ là 107% so với lô đối chứng. Nhƣ vậy sau khi tƣới nƣớc đƣợc 3 ngày, huỳnh quang ổn định giảm khá rõ rệt, tuy nhiên vẫn còn cao hơn so với lô đối chứng, hiện tƣợng này có thể lí giải nhƣ sau: trong quá trình tƣới nƣớc trở lại, sự thiếu hụt nƣớc của lá giảm dần do đó làm giảm bớt sự tổn thƣơng cấu trúc protein của trung tâm phản ứng PS II, dẫn đến năng lƣợng dùng cho quá trình quang hóa tăng lên. Đến ngày thứ 11, huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm và lô đối chứng không có biểu hiện rõ rệt, hiện tƣợng này có thể đƣợc lí giải là do bộ máy quang hợp đã dần đƣợc phục hồi trở lại. Sang đến ngày thứ 12, huỳnh quang ổn định của lô thí nghiệm tiếp tục tăng, còn lô đối chứng vẫn ổn định, do đó đã tạo lên sự chênh lệch so với lô đối chứng là 5%, nguyên nhân là do nhiệt độ môi trƣờng tăng cao (30,80C) và cƣờng độ ánh sáng tăng cao (20200Lux) (phụ lục 1). Đến ngày thứ 13 và 14, huỳnh quang ổn định giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng là tƣơng đƣơng nhau, điều này phản ánh khi đƣợc cung cấp nƣớc đầy đủ sẽ tạo điều kiện cho các enzym của quá trình quang hợp hoạt động trở lại, số lƣợng các trung tâm ở trạng thái “mở” đi vào trạng thái hoạt động ổn định, năng lƣợng dùng cho quá trình quang hóa không còn bị hao phí khi chuyển đến các trung tâm phản ứng và giảm bớt bức xạ huỳnh quang ổn định. Nhƣ vậy, khi tƣới nƣớc trở lại, huỳnh quang ổn định giảm dần. Khi nghiên cứu quá trình khô hạn ở một số giống cây đậu tƣơng, Nguyễn Văn Hiếu và Nguyễn Văn Mã [7] cũng cho kết quả là khi cung cấp nƣớc trở lại thì huỳnh quang ổn định giảm.
3.1.1.2. Động thái huỳnh quang cực đại của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con giai đoạn cây con
Kết quả thí nghiệm về huỳnh quang cực đại của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con đƣợc thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Động thái huỳnh quang cực đại của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con
Quá trình thí nghiệm
Huỳnh quang cực đại (Fm)
Đối chứng Thí nghiệm % Đối
chứng
Giai đoạn gây hạn (ngày) 1 1598,4 ± 18,6 1573,8 ± 18,1 98 2 1577,3 ± 19,7 1530,5 ± 25,4 97 3 1575,6 ± 22,1 1515,6 ± 25,9 96 4 1632,5 ± 25,1 1505,7 ± 23,9 92* 5 1644,6 ± 23,5 1498,5 ± 16,4 91* 6 1538,7 ± 22,8 1503,7 ± 29,3 98 7 1525,7 ± 13,8 1436,1 ± 38,2 94* Giai đoạn phục hồi (ngày) 8 1588,9 ± 16,7 1527,8 ± 18,9 96* 9 1613,4 ± 24,4 1519,7 ± 36,4 94* 10 1673,8 ± 27,6 1622,6 ± 23,5 97 11 1697,1 ± 29,5 1658,6 ± 17,1 98 12 1655,6 ± 19,1 1614,3 ± 31,9 98 13 1636,6 ± 11,8 1753,2 ± 35.0 107* 14 1657,4 ± 17,4 1628,8 ± 27,8 98
Ghi chú: Dấu * chỉ sự sai khác giữa thí nghiệm và đối chứng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy trên 95%
Huỳnh quang cực đại (Fm) là tham số biểu hiện huỳnh quang cực đại đo đƣợc khi toàn bộ trung tâm phản ứng ở trạng thái “đóng”, khi chất nhận điện tử đầu tiên QA khử.
Hình 3.2. Động thái huỳnh quang cực đại của ngô trong quá trình bị khô hạn ở giai đoạn cây con
Số liệu bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy, khi ngừng tƣới nƣớc 3 ngày, giá trị huỳnh quang cực đại của lô thí nghiệm so với lô đối chứng không có sự biến động, chứng tỏ hạn chƣa tác động rõ rệt đến sự khử các chất khử đầu tiên QA. Sang đến ngày thứ 4, 5 giá trị huỳnh quang cực đại giảm rõ rệt, thể hiện qua tỉ lệ chênh lệch so với lô đối chứng lần lƣợt là 92%, 91%. Điều này chứng tỏ, khi ngừng cung cấp nƣớc sẽ ảnh hƣởng đến bộ rễ, do đó giảm lƣợng nƣớc lên lá làm cho các trung tâm phản ứng P680 và P700 sẽ “đóng”, lúc này ảnh hƣởng đến sự khử các chất nhận điện tử đầu tiên QA, đồng thời diễn ra sự tổn thƣơng protein D1, D2 dẫn đến huỳnh quang cực đại giảm. Sang đến ngày thứ 6, huỳnh quang cực đại của lô thí nghiệm và lô đối chứng xấp xỉ nhau thể hiện qua tỉ lệ 98%. Đến ngày gây hạn thứ 7, huỳnh quang cực đại của lô thí nghiệm vẫn thấp hơn so với đối chứng, nhƣng trong tƣơng quan so sánh với ngày thứ 4, 5 thì mức giảm của huỳnh quang cực đại giảm ít hơn, đƣợc thể hiện qua tỉ lệ so với lô đối chứng là 94%. Hiện tƣợng này có thể cho rằng, khi gặp hạn ở ngày thứ 7, bên cạnh việc hình thành các chất bảo vệ tế bào nhƣ
glycine betaine, prolin, các nhóm đƣờng [37], thì axit ABA nhanh chóng đóng các lỗ khí khổng bằng việc bơm các ion bảo vệ, do đó hạn chế sự mất nƣớc,