2.1.2.1. Xây dựng phương thuốc Đan Phụ.
Công thức: Đan sâm 200g
Cao khô Phụ tử 30g.
2.1.2.2. Nghiên cứu về hỏa học 1) Định tính.
a) Định tính alkaloid.
- Định tính bằng thuốc thử chung của Alkaloid [4],[ 10'.
- Định tính bằng phổ hấp thụ tử ngoại quét phổ ở bước sóng 300 - 200 nm [10],[38\
c) Định tính bằng thuốc thử PeCla [10].
d) Phát hiện chất phát quang ở bước sóng 365nm [10],[38].
2)Định lượng.
Định lượng Alkaloid toàn phần bằng phương pháp acid- base 4],[10],[38].
Nguyên tắc:
Chiết Alkaloid bằng dung môi thích hợp trong môi trưÒTig kiềm, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn trong một vài ml ethanol. Tiến hành định lượng bằng cách lắc với Alkaloid trong dung môi với nước với lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng acid dư bằng kiềm tương ứng(NaOH) với chỉ thị đỏ Methyl.
2.1.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học:1) Thử tác dụng trên động mạch cảnh mèo. 1) Thử tác dụng trên động mạch cảnh mèo.
- Nguyên tắc: đo trực tiếp lưu lượng máu chảy qua động mạch cảnh mèo đã gây mê. So sánh lưu lượng máu chảy qua động mạch cảnh trước và sau khi truyền thuốc Đan phụ. Nếu lưu lượng máu sau khi truyền thuốc lớn hơn lưu lượng máu trước khi truyền thuốc tức là thuốc có tác dụng tăng tuần hoàn động mạch cảnh.
Chỉ tiêu theo dõi: Lưu lượng máu qua động mạch cảnh ở những thời điểm 5 phút trước truyền và sau truyền thuốc.
Chỉ tiêu đánh giá:
+ So sánh lưu lượng máu qua động mạch cảnh (ml/phút) trước khi bơm thuốc và sau khi bơm thuốc qua đưòng tĩnh mạch cảnh mèo bằng test T.
+ So sánh tỷ lệ (%) tăng lun lượng máu qua động mạch cảnh của bài thuốc Đan Phụ với mẫu Tanakan.
Tỷ lệ (%) tăng lưu lượng máu (ml) qua động mạch cảnh sau so với trước tính theo công thức:
Vs- Vt ^
X = __ 1 ^ 100 Vt
Trong đó Vs: lưu lượng máu não trước khi truyền thuốc. Vt: lưu lượng máu não sau khi truyền thuốc.
X: tỷ lệ (%) tăng lưu lượng máu não sau khi truyền thuốc so với trước khi truyền thuốc.
Thuốc có tác dụng khi Vs >Vt (P< 0.05).
3) X ử lý kết quả thực nghiệm:
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê toán học.
Kiểm định sự khác biệt giữa hai giá trị trung bình bằng test Studen (test T).[15]
Khoảng tin cậy được xác định theo công thức: |i = X ± S E .
Trong đó X là giá trị trung bình của tỷ lệ (%) tăng lưu lượng tuần hoàn qua động mạch cảnh so với trước khi tiêm thuốc của mẫu nghiên cứu trên lô nghiên cứu.
SE là sai số chuẩn.
ở ngưỡng 95%, khi p > 0.05 hai giá trị trung bình khác nhau không có ý nghĩa thống kê, khi p < 0.05 hai giá trị trung bình khác nhau có ý nghĩa thống kê (trợ giúp bởi phần mềm Microsolf excel).
2.L2.4. Nghiên cứu về bào chế.
- Bào chế viên nén theo phương pháp xát hạt ưót.
- Đánh giá chất lượng viên nén (phụ lục 2 ): + Độ cứng[10\
+ Độ rã[10\
+ Độ mài mòn [10].
2.2. THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ. 2.2.1. Bào chế phương thuốc Đan Phụ.
- Bài thuốc Đan sâm 200g Cao khô Phụ tử 30g - Quy trình chiết xuất:
• Bào chế cao lỏng Đan sâm (CLĐS) (tỷ lệ 2:1):
Đan sâm rửa sạch, loại tạp, thêm 2 lít nước, đun sôi trong Ih (trong khi đun nước bổ sung nước sao cho nước luôn ngập dược liệu), Lọc nóng dịch sắc qua bông, thu dịch sắc lần 1. Các lần 2,3 thêm tiếp nước và thực hiện giống quy trình lần 1, thu dịch sắc lần 2, lần 3. Gộp dịch sắc 3 lần, cô thành cao lỏng 2: l(lm l cao lỏng chứa 2g dược liệu).
Loại tạp: cho đồng thể tích Ethanol 90® vào dịch sắc ở trên, khuấy kỹ trong Ih, để lắng qua đêm. Lọc qua bông thu được dịch sắc cồn lần l.Phần bã còn lại thêm tiếp lOOml cồn tiếp tục quy trình loại tạp như trên ta thu được dịch chiết trong cồn lần 2. Gộp dịch chiết cồn lần 1, 2, cô cách thủy đến hết cồn, thêm nước đến thể tích cao lỏng 2:1.(CLĐS)
• Bài thuốc Đan Phụ(ĐP); khi sử dụng ta phối hợp CLĐS với Cao khô Phụ tử theo tỷ lệ trên.
2.2.2. Kết quả nghiên cứu hóa học.
2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu.
Mầu 1: Cao khô Phụ tử (C K PT): Ig.
Mầu 2 : Bài thuốc Đan Phụ (ĐP)(chứa tương ứng Ig Cao khô Phụ tử). Mầu 3 : Đan sâm (ĐS) : 7g.
Mau 4 : Phụ tử sống (P T S ): Ig.
2.2.2.2. Đinh tỉnh.
a) Định tính bằng thuốc thử chung của alkaloid. ■Mầu nghiên cứu: CKPT, ĐP, PTS, ĐS.
■ Chiết xuất:
Các mẫu nghiên cứu được cho vào các bình nón có nút mài dung tích 50ml, thêm 5ml NH4OH đặc. Sau 10 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa, lắc đều, đậy kín, để 30 phút (thỉnh thoảng lắc). Lọc lấy lớp ether, làm khan bằng Natri
Sulfat khan, lọc, bay hơi dịch lọc trên nồi cách thủy đến cắn.
■Định tính:
Hòa tan cắn bằng 5ml H2SO4 loãng (10%) chia đều vào 3 ống nghiệm. Ống 1: nhỏ 2ml thuốc thử Dragendroff.
Ống 2: nhỏ 2ml thuốc thử Bouchardat. Ống 3: nhỏ 2ml thuốc thử Mayer. Kết quả được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả định tính alkaioid của các MNC.
Mầu
nghiên cứu Kết quả phản ứng Kết quả
Dragendorff Bouchardat Mayer
PTS Tủa đỏ cam Tủa nâu9 /V Tủa trăng (+)
ĐS Không tủa Không tủa Không tủa (-)
PTCK Tủa đỏ cam Tủa nâu Tủa trăng (+)
ĐP Tủa đỏ cam Tủa nâu Tủa trăng (+)
Ghi chú: (+) phản ứng dương tính (-) phản ứng âm tính. Nhận xét:
- Các mẫu PTS, PTCK, ĐP (chứa Phụ tử ) đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung của alkaloid.
- Mầu ĐS (chỉ có Đan sâm) có phản ứng âm tính với thuốc thử chung của alkaloid.
b) Định tính bằng phổ hấp thụ tử ngoại
■ Chiết xuất:
Cho mẫu nghiên cứu vào bình nón có nút mài dung tích 50ml thêm 30ml Ethanol và 5ml dung dịch Amoniac đặc, lắc mạnh trong vòng 20 phút, lọc. Dịch lọc được cho vào binh gạn dung tích lOOml, thêm 20ml dung dịch H2SO4 0.5N, lắc manhjtrong 20 phút, để yên cho tách lớp, gạn lấy dịch acid pha loãng đến nồng độ thích họp, quét phổ hấp thụ tử ngoại ư v từ 300-
200nm.
Kết quả được thể hiện ở hình 2.3, hình 2.4, hình 2.5.
Report Date: 15:28; 58. 03/20/2007
Abs
PTsong
200 250 300 nm
0.1049 Cao kho Phu tu 18 Apr 2007 Gain 147 SBU 2.0
_ABS______________Basel ine_____OFF Page 3__________ 300.00
_____ m 3.0000 2.0000. 1.0Ũ0Ũ- 0.0000-^ DISPLAŸ DATA 200.30 300.00 ^BS_________ : 0.0000 -> 3.0000________ NM : 200.00 -> 300. QQ
3aseJine Erase Uiew Re-scale Zoom Cursor i?W!fgH More Jrite labels on the graphgraph
Hình 2.4. Phổ u v alkaloid của Phụ tử cao khô.
0 Cao kho Phu tu 18 Apr 2007 U . j t S Z l Gain 145 SBU 2.0
_______ B a s e l iiie____ OFF Page__ 3--- ----
300.00 NM 3.0000' 2.0000. 1.0000- 0.0000 DISPLAY DATA 232nm
Bai thuoc Dan phu
. 274nn U U “ |--- I _____ I 200.00 220.00 I ---- r 240.00 I ---- r 260.00 —I !----1— 280.00 300.00 NM : 200.00 -> 300.00 ABS : Q.nnOQ -> 3.0000__________ Nt1 : 200.00
Baseline Erase Uiew Re-scale Zoom Cursor Write labels on the g r a p h _________________
Nhận xét:
- Phổ u v alkaloid Phụ tử sống có cực đại hấp thụ ở bước sóng kmax
=232nm.
- Phổ u v alkaloid phụ tử cao khô có cực đại hấp thụ ở bước sóng >-niax =232nm và >,niax'^274nm.
- Phổ u v alkaloid của bài thuốc Đan Phụ có cực đại hấp thụ ở bước sóng >u„,ax =232nm và )tn,ax=274nm.
- Kết quả nghiên cứu phù hợp với công bố của các tác giả[13] và DĐVN, DĐTQ.
2) Phát hiện chất phát quang.
■Mầu nghiên cứu: CKPT, ĐP, ĐS, CLĐS. ■ Chiết xuất:
- Đối với các mẫu CKPT, ĐP, ĐS.
Mầu nghiên cứu nghiền mịn (ĐS), cho vào cốc có mỏ dung tích lOOml, thêm 50ml nước cất, đun sôi cách thủy trong 15-20 phút, để nguội, lọc. Dịch lọc thu được đem cô cách thủy đến khô thu được cắn. Hòa tan cắn trong 5ml Ethanol 90®, lọc, dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng hóa học.
- Đối với mẫu CLĐS: Chiết theo quy trình ở mục 2.2.1. • Soi đèn u v bước sóng 365nm.
Lấy Iml dịch chiết các mẫu nói trên nhỏ lên giấy lọc, để bốc hơi đến khô, quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
Kết quả được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Phản ứng phát quang của các mẫu nghiên cứu.
Mau nghiên cứu Kêt quả phản ứng Kết quả Đèn tử ngoại Ằ,=356nm
ĐP Huỳnh quang xanh lơ (+)
CLĐS Huỳnh quang xanh lơ (+)
ĐS Huỳnh quang xanh lơ (+)
Ghi chú: (+) phản ứng dương tính (-) phản ứng âm tính. Nhận xét:
- Các mẫu ĐP , ĐS , CLĐS (chứa Đan sâm ) đều cho huỳnh quang xanh khi soi dưới đèn u v bước sóng 365nm.
- Mầu CKPT (chứa riêng Phụ tử cao khô) không có huỳnh quanh xanh khi soi dưới đèn u v bước sóng 365nm.
3) Định tính bằng thuốc thử PeCls 5%.
• Mầu nghiên cứu: Mầu CKPT, ĐP, ĐS, CLĐS. • Chiết xuất: theo quy trình ở mục 3.1.2
Lấy Iml dịch chiết trên cho vào ống nghiệm, thêm l-2ml dung dịch PeCla 5%.
Kết quả được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kết quả định tính bằng thuốc thử FeCỈ3 5%.
Mầu nghiên cứu Kêt quả phản ứng Kết quả
ThuôcthửPeCls 5%
ĐP Có màu lục bân (+)
CLĐS Có màu lục bân (+)
ĐS Có màu lục bân (+)
CKPT Không đôi màu (-)
Nhận xét:
- Các mẫu ĐP, ĐS, CLĐS (chứa Đan sâm) đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử FeCl3 5%.
- MỄu CKPT (chứa riêng Phụ tử cao khô) cho phản ứng âm tính với thuốc thử PeCla 5%.
4).Định tính bằng thuốc thử Nessler.
• Chiết xuất:
- Mầu ĐP, CKPT, ĐS:
Cho các mẫu vào cốc có mỏ, thêm 5ml Ethanol, đun sôi, lọc thu được dịch lọc
- Đối với mẫu CLĐS : quy trình chiết giống như quy trình chiết ở mục 3.1.2.1.
Dịch lọc của mẫu ĐP, CKPT, ĐS và cao lỏng CLĐS cho vào ống nghiệm, thêm l-2ml thuốc thử Nessler.
Kết quả được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Kết quả định tính bằng thuốc thử Nessler.
Mầu nghiên cứu Kêt quả phản ứng Kết quả
Thuôc thử Nessler
ĐP Tủa màu nâu đât (+)
CLĐS Tủa màu nâu đât (+)
ĐS Tủa màu nâu đât (+)
CKPT Không xuât hiện tủa (-)
Nhận xét:
- Mau ĐP, ĐS, CLĐS (chứa Đan sâm) cho phản ứng dương tính với thuốc thử Nessler.
- Mầu CKPT (chứa riêng cao khô phụ tử) có phản ứng âm tính với thuốc thử Nessler.
2.2.2.3.Định lượng alkaloỉd.
Áp dụng phương pháp của Dược điển Trung Quốc có cải tiến để định lượng alkaloid trong cao khô Phụ tử.
• Mầu nghiên cứu: mẫu CKPT. • Chiết xuất:
Xác định hàm ẩm của mẫu nghiên cứu bằng cân xác định độ ẩm tự động. Cân chính xác mẫu nghiên cún đã xác định hàm ẩm. Cho mẫu nghiên cứu vào bình nón có nút mài dung tích 150ml. Thêm 50ml hỗn hợp Ether - Chloroform(tỷ lệ 3:1) và 4ml dung dịch Amoniac đặc. Đậy nắp, lắc kỹ, để qua đêm. Lọc, thu lấy dịch lọc. Rữa bã bằng 50ml hỗn họp Ether - Chloroform(tỷ lệ 3:1), lắc liên tục trong Ih, lọc, thu dịch lọc. Rửa lần 2,3,4 bằng 15ml hỗn hợp Ether - Chloroform nói trên, thu dịch lọc lần 2,3,4. Gộp dịch lọc, bốc hơi cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn thu được bằng 5ml Ethanol, thêm 15ml H2SO4
0.02N và 15 ml nước cất. Để yên 15 phút, thêm 2 giọt thuốc thử đỏ methyl. Chuẩn độ H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0.02N đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng.
Mỗi Iml dung dịch H2SO4 0.02N tương đương 12.9mg Aconitin [38;.
•Hàm lượng alkaloid trong mẫu cao khô Phụ tử được tính theo công thức:
Kh2S04 X 1 5 -V N a O H X KNaOH
X(%) = _______ _ _^__ X 12,9 P (l-a )x 10
Trong đó: X là hàm lượng alkaloid toàn phần(%) p là khối lượng cao khô phụ tử (gam) a là độ ẩm của mẫu cao khô phụ tử (%).
K là hệ số hiệu chuẩn của dung dịch acid, base đem chuẩn độ. VNaOH là thể tích NaOH tham gia phản ứng (ml)
Mâu nghiên cứu P (g) a (%) VNaOH (ml) X (%) CKPT 1 1.0305 9.16 13.20 2.4740 2 1.0205 9.16 13.15 2.5678 3 1.010 9.16 13.30 2.3493 4 1.1400 9.16 13.15 2.3340 5 1.1000 9.16 13.20 2.290 X±SE 2.4030±0.0513 Với KNaOH = 1.087; K h 2 S 0 4 = 1.076; Nhận xét.
Hàm lượng alkaloid toàn phần trong Phụ tử Cao khô có giá trị khoảng 2.4(%).
2.2.3.Nghỉên cứu tác dụng sinh học.
2.2.3.1. Chuẩn bị dung dịch chế phẩm.
- Dung dịch chế phẩm thử bài thuốc Đan Phụ (ĐP) :
Cao khô Phụ tử thêm 50ml nước cất, đun cách thủy đến sôi, vừa đun vừa khuấy mạnh đến khi phụ tử tan hoàn toàn. Đe lắng Ih, lọc lấy dịch chiết lần 1. Phần bã cho thêm 50ml nước, tiếp tục quy trình trên, ta thu được dịch chiết lần 2. Gộp dịch chiết Phụ tử với cao lỏng Đan sâm (CLĐS), cô cách thủy đến cao lỏng Đan phụ (tỷ lệ 2:1) CLĐP) (Iml CLĐP tỷ lệ 2:1) tưoTig đương 3 12.9mg cắn khô CLĐP) được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ thích hợp, ly tâm, thu lấy dịch trong.
Quy dược liệu về cắn: Lấy Iml CLĐP (2:1), sấy khô đến cắn có khối lượng không đổi, cân cắn. Iml CLĐP tương đương 312.9mg cắn khô CLĐP, tương đương 2g DL).
Dịch trong là chế phẩm thử.
> Mầu đối chiếu: thuốc Tanakan, viên nén, hàm lượng 40mg, sản phẩm chiết xuất từ cao Bạch quả.
* Chuẩn bị mẫu đối chiếu: Nghiền mịn thuốc Tanakan, hòa tan trong nước nóng cho đến khi tan gần hoàn toàn. Đem ly tâm thu lấy dịch trong làm dung dịch chế phẩm tham chiếu.
2.2.3.2. Thử tác dụng trên động mạch cảnh mèo.
Tiến hành song song trên 3 lô, mỗi lô từ 4-9 con.
Lô 1: thử với dung dịch chế phẩm CLĐP với hàm lượng tương đương 40mg cắn khô CLĐP/kg mèo (tương đương 384mg DL/kgtt mèo).
Lô 2: thử với dịch chiết Tanakan với hàm lượng tương đương 20mg/kgtt mèo. Lô 3: thử vói dịch chiết Tanakan vói hàm lượng tương đương 40mg/kgtt mèo. Tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị mèo
Gây mê mèo bằng dung dịch Urethan 25%. cố định mèo trên bàn mổ, bộc lộ động mạch cảnh, luồn nhẹ hai sợi chỉ qua động mạch cảnh, cặp máy đo lưu lượng máu, cố định bằng chỉ. Bộc lộ tĩnh mạch đùi, dùng kéo cắt vát hình chữ V, luồn nhẹ kim truyền vào tĩnh mạch, cố định kim truyền vào máy bơm tự động sao cho không được có bọt khí.
Bước 2: Đo lưu lượng máu qua động mạch cảnh.
* Ồn định mô hình nghiên cứu: Tiêm 5ml nước muối sinh lý vào tĩnh mạch đùi, kiểm tra lưu lượng máu qua động mạch cảnh (ml) ở những thời điểm 5 phút cho đến khi lưu lượng máu ổn định, thời điểm đó là giá trị Vt.
* Tiêm 5ml dung dịch chế phẩm cần thử qua tĩnh mạch đùi, theo dõi lưu lượng máu qua động mạch cảnh (ml) ở những thời điểm 5 phút. Giá trị lưu lượng máu qua động mạch cảnh lớn nhất là giá trị Vs.
Ket quả được thể hiện ở bảng 2.6
Bảng 2.6. Lưu lượng máu chảy qua động mạch cảnh của mèo trước và sau khi truyền thuốc.
Mầu thử Liều thử (mg cắn /kg mèo) Mèo Lưu ] máu(n động mí iượng il) qua ich cảnh Tỷ lệ (%) tăng so với trước Thay đổi 1 9.4 12.1 28.7 (+) 2 6.9 7.6 10.2 (+) 3 12.6 13.3 5.6 (+) 4 8.6 11.6 34.9 (+) 40 5 3.8 5.4 42.1 (+) 6 6.8 7.8 14.7 (+) CLĐP 7 7.4 10.2 37.8 (+) 8 6.9 8.2 18.9 (+) 9 4.7 5.2 10.6 (+) X ±SE 22.61±4.5 0 1 10.0 11.9 19.0 (+) 2 6.6 8.5 28.8 (+) 3 6.6 7.5 13.6 (+) 20 4 4.1 4.4 7.3 (+) 5 4.9 5.6 14.3 (+) 6 8.7 10.0 14.9 (+) 7 8.9 10.3 15.7 (+)