Phổ khối lượng được ghi trên máy HP-5989-MS tại phòng Phân tích cấu ưúc, Viện Hóa học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam).
Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành ghi phổ của 4 chất (I, III, V và VI).
Phổ đồ được ghi ở các hình 15-18. Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất I, ni, V, VI đều có pic phân tử, có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến. Ngoài ra phân tích phổ đồ cho phép nhận biết các pic phân mảnh của bốn chất này phù hçfp với sơ đồ phân mảnh và phù hợp với các tài liệu tham khảo
Bảng 6: Số liệu khối phổ của chất I và chất VỊ
Chất Cống thức cấu tạo m/z I í ó M = 18i8 188 (M") 1 1 7 (M ^ -H N C 0 -C 0 ) 90 0 1 7 -H C N ) 63 (90- C 2H2- IH) III A ^ HN ì M = 233 N O 2 233 (MO 162 (M^ - HNCO - CO) 1 1 6 (1 6 2 -N 0 2 ) 89 Ù 1 6 -H C N ) 63 (8 9 -C ,H ,) V o H T ị [ o M = 231 . N ( C H 3 ) 2 231 (M+) 160 (M ^-H N C O -C O ) 1 1 6 a 6 0 - N ( C H 3 ) 2 ) 89 (116-H C N ) 6 3 (8 9 - Q H 2 ) VI o Ịítì M = 204, 0H 204 (M^) 187 (M -O H ) 161 (M -H N C O ) 133 0 6 1 - CO) 106 0 3 3 - H C N ) 78 Ò 0 6 -C O )
Sơ đồ phân mảnh của chất V: o (CH3)2N- \ \ / / -CH=C=NH + m/z 160 - k c H ^ h m/z 116 - H C N 1r m /z 89 C5H3 m/z 63
2.4 Thử hoạilỉháng dòng tê bào ung thư ngưòị
Một số công trình trên thế giới và trong nước đã công bố kết quả thử hoạt tính chống tế bào ung thư của một số dẫn chất của Các kết quả đó đã định hưdíng chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tí
dòng tế bào ung thư người của một số đẫn chất của hydantoin do chúng tôi tổng hợp với mong muốn góp phần tìm kiếm các thuốc chống ung thư.
2.4.1 Nguyẽn tác
Tiến hành theo phưcmg pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
Dòng tế bào nghiên cứu:
+ Hep-2: Tế bào ung ũiư gan ở ngườị + LU: Tế bào ung thư phổi ở ngườị
2.4.2 Tiến hành
Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện ở phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện Khoa học và công nghê Việt Nam theo quy ưình sau đây:
Tế bào ung thư được duy trì liên tục ở điểu kiện chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log, sẽ được sử dụng cho test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4-10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lẩn trên vi lượng 96 giếng trong dung môi dimethylsulfoxyd (DMSO) 10%.
Phiến thử nghiệm được ủ trong tủ Ễ&n C02/37°C/48-72h để tế bào tiếp tục phát triển, bao gồm: Tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử. Sau đó lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hòa lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa, bước sóng 495-515nm.
Nồng độ ức chế tế bào ung thư của chất thử được tính bằng giá trị IC50. Giá trị này được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarid dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị mật độ quang (optical density - OD) đo được.
Các mẫu chất tinh khiết có giá trị IC50 <5 Ịig/ml được coi là có hoạt tứửị Kết quả thử nghiêm được ghi ở bảng sau:
Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư ngưòí của các chất thử.
STT Chất
Dòng tế bào - Giá trị IC50
(^g/mI) Kết luận Hep-2 1 I >5 >5 Am tính 2 II 0,65 >5 Dương tính 1 dòng 3 m 3,07 >5 Dưcmg tính 1 dòng 4 IV 4,56 >5 Dưctng tính 1 dòng 5 V 0,54 >5 Dương tính 1 dòng 6 VI >5 >5 Am tứứi 7 vn >5 >5 Am tính 2.5 Bàn luận 2.5.1 Về tổng hợp hóa học
* Đã khảo sát, so sánh 2 phương pháp ngưng tụ các aldehyd thơm với hydantoin là: dùng xúc tác AcONa trong AcOH (PPl) và dùng diethanolamin vừa làm xúc tác vừa làm dung môl (PP2) để tìm điều kiện phản ứng thích hợp cho hiệu suất caọ
* Kết quả thực nghiêm cho thấy:
+ Phản ứng tổng hợp chất (I) (dùng benzaldehyd) và chất (II) (dùng p- clorobenzaldehyd) theo 2 phương pháp cho hiệu suất gần như tưcfng đương nhau, tuy nhiên phương pháp 2 cho thời gian phản ứng ngắn hcfn rõ rệt-
+ Phản ứng tổng hợp 3 chất (V), (VI), (vn) vód các hợp phần aldehyd lần lượt là p-dimethylaminobenzaldehyd, aldehyd salicylic, vanillin có hiệu suất
phản ứng theo phưcmg pháp 2 cao hcfn rõ rệt so với phưcíng pháp 1
(80,73%-ỉ-50,69% so với 8,97%^3,24%). Thời gian phản ứng theo phưcíng
pháp 2 cũng ngắn hơn hẳn ( 1 0 phút so với 6-^7 giờ).
+ Phản ứng tổng hợp 2 chất (HI), (IV) với các aldehyd là meta và paranitrobenzaldehyd không thực hiện được theo phucfng pháp 2. Phưcỉng pháp 1 cho hiệu suất phản ứng như các tài liệu đã công
* Có thể giải thích các kết quả thực nghiêm như sau:
+ Xúc tác diethanolamin là một tác nhân nucleophilic mạnh đã hoạt hóa nhóm methylen của hydantoin mạnh hơn nhiều so với NaOAc/AcOH (xúc tác này có tính nucleophilic yếu), do đó carbanion của hydantoin tạo thành nhiều hcfn và tấn công vào họfp phần aldehyd cũng mạnh hcfn. Kết quả là thời gian phản ứng khi dùng xúc tác này ngắn hơn hẳn so với khi dùng xúc tác NaOAc/AcOH trong các phản ứng tổng hợp 5 chất (I, n, in, IV, V).
+ Đối với phản ứng tổng họfp 2 chất (I) và (II), độ bền của ion alcolat trung gian ứng với benzaldehyd và p-clorobenzaldehyd ít chịu ảnh hưỏng của môi trường phản ứng do đó hiệu suất thu được là tương đương nhau ở cả hai phưoíng pháp.
+ Đối với phản ứng tổng hçfp 3 chất (V), (VI) và (VII), do sự tấn công với sô' lượng nhiều hofti của các carbanion của hydantoin và thuận lợi về mặt nâng lượng nhờ các nhóm đẩy điện tử có trong các aldehyd thom, do đó các ion alcolat trung gian được tạo thành nhanh hơn và bền hofn trong môi trường kiềm mạnh (diethanolamin), vì vậy phưcmg pháp 2 cho hiệu suất cao hoín hẳn và thời gian phản ứng ngắn hcín rõ rệt so với phưcmg pháp 1.
+ Đối với phản ứng tổng hợp 2 chất (m ) và (IV), có lẽ trong môi trường kiềm mạnh (diethanolamin) và nhiệt độ cao (HÓ^C), các ion alcolat có chứa nhóm hút điện tử mạnh là “NO2 tạo thành rất không bền, do đó phản ứng không thực hiện được theo phưmg pháp 2. Ngược lại trong môi trường acid
acetic, pH acid kết hợp với hiệu ứng hút điện tử manh của nhór, hoạt hóa nhóm aldehyd do đó hiệu suất phản ứng tổng hợp hai ch (IV) theo phưcíig pháp 1 tưang đối caọ
2.5.2 Về xác định cấu trúc
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ đã kết luận cấu trúc của các chất tổng hợp được đúng như dự kiến.
2.5.3 Về tác dụng sinh học
* Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư theo người cho thấy trong số 7 dẫn chất 5-arylidenhydantoin tổng họip được, có 4 chất có tác dụng (n, rũ , rv , V) trong đó hai chất II và V có tác dụng rất mạnh (giá trị IC50 là 0,65 và 0,54 |ag/ml). Ba chất I, VI, VII không có tác dụng.
+ Kết quả trên cho thấy dẫn chất 5-aryliđenhydantoin có tiềm năng kháng tế bào ung thư rất đáng quan tâm.
Về mối ỉỉên quan cấu trúc - tác dụng chống ung thư, có thể nhận xét như
sau: ^
+ Các nhóm thế ở nhân thcfm của hợp phần aldehyd có ảnh hưởng đến hoạt tính chống ung thư của các chất như kết quả đã trình bày ở trên.
+ Có thể giả thiết rằng các nhóm thế đã ảnh hưởng đến độ phân cực của
liên kết c = c trong nhóm carbonyl a-P không no có trong phân tử. Đây là yếu tố cấu trúc có thể phản ứng với các chất ái nhân sinh học (có chứa nhóm thiol, amin) làm rối loạn chuyển hóa acid nucleic dẫn tới thay đổi hình thái nhiễm sắc thể của nhân tế bào đang phân chia dẫn tới tác dụng chống ung thư.
+ Ngoài các yếu tố cấu trúc nêu trên, chúng tôi cũng hiểu rằng tác dụng chống ung thư và các tác dụng sinh học khác thu được phụ thuộc vào cấu trúc và các tính chất hóa lý của toàn phân tử.
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1 Kết luận
1. Chúng tôi đã tổng hợp được 7 dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-VII)
trong đó 2 chất (IV,V) chưa thấy trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo
được.
2. Đã khảo sát phản ứng ngưng tụ của hydantoin với một số aldehyd thơm
theo hai phưoíng pháp (dùng xúc tác NaOAc khan trong AcOH băng và dùng
diethanolamin làm XÜC tác và dung môi). Kết quả cho thấy với các aldehyd
thơm có nhóm thế đẩy điện tử thì phưcfng pháp dùng diethanolamin làm xúc
tác và đung môi cho hiệu suất cao hcfn hẳn và thời gian phản ứng ngắn hơn
rõ rệt so với phương pháp dùng xúc tác NaOAc khan trong AcOH băng.
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM, xác
định cấu trúc bàng phổ hổng ngoại, phổ tử ngoại và khối phổ. Kết quả cho
phép chúng tôi kết luận các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự
kiến.
4. Đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư của bẩy chất tổng hcfp được
(I-^VII) đối với 2 dòng tế bào ung thư ở người là tế bào ung thư gan (Hep-2)
và tế bào ung thư phổi (LU), Kết quả cho thấy bốn chất (II, III, IV và V) có
tác dụng ức chế chọn lọc dòng tế bào Hep-2, trong đó hai chất (II và V) có
và chất V). Ba chất I, VI và vn không có tác dụng trên hai dòng tế bào đã thử.
3.2 Đề xuất
+ Về tổng hợp hóa học: Cần tiếp tục khảo sát và tìm các điều kiện phản
ứng tối ưu cho từng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel của hydantoin với các
aldehyd thcrm để đạt được hiệu suất và hiệu quả kinh tế cao nhất.
+ Về tác dụng sinh học: Cẩn tiếp tục khảo sát sâu hơn về hoạt tính chống
ung thư của các dản chất dãy 5-arylidenhydantoin với hy vọng tìm ra các
chất có tác dụng mạnh và ít độc tính.
+ Chúng tôi cho rằng việc tiếp tục tổng hçfp và sàng lọc hoạt tính sinh
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] Bộ môn Dược lý (2004), Dược lý học, Trường Đại học Dược Hà Nội,
tập n, tr.215-230,
'2] Bộ môn Hóa hữu cơ (1999), Hóa hữư cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập II, tr.170-171, 175.
[3] Dược điển Việt nam ĩ ỉ ỉ (2002), Nhà xuất bản Y học, tr.218.
[4] Đinh Thị Hải (2003) “Tổng hợp và ĩhãm dò tác dụng sinh học của 5- (3'-nitrohenzylỉden)-imidazolidin-2,4-đion và dẫn ch ấ t”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, t r l 7 , 18.
[5] Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Việt Hà (2002), “Tổng họfp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-(5’-nitro-2’- furfuryliden)-imidazolidin-2,4-dion và dẫn chất”, Tạp chí Dược học, 7, tr.l4-
15.
[6] Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai Hưcfng (2003), “Nghiên cứu hoạt túih gây độc tế bào của một số dẵn chất 5-nitrofurfurar’,
Tạp chi Dược học, 1, tr .l8.
[7] Heinz Beaker và cộng sự (1967), Thực hành hóa hĩai cơ, Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh dịch, Nhà xuất bản Khoa học kỳ thuật, tr.88-91, 109- 114.
[8] Hoàng Tích Huyền, Đào Vãn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1998),
Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, tr.225-227.
[9] Hoàng Trọng Yêm (chủ biên) (2000), Hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tập 3, tr.150-152.
10] Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật ỉý ứng dụng trong hóa học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nộị
[11] Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tập 1.
[12] Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Vũ Trần Anh, Nguyễn Thị Thu Hưotig (2005), ‘Tổng hợp và hoạt tính chống ung thư của một sô dẫn xuất của hydantoin”, Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và cồng nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc ìần thứ J, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội, tr.41-45.
[13] Nguyễn Thị Thu Hưofng (2004) “Tổng hợp và thâm dồ tác dụng sinh học của 5-ịp-cỉorobenzyỉiden)-imidazolidin~2,4-dion và dẫn ch ấ t”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, trl7 , 18.
[14] Phan Tống Sơn, Trần Quốc Scfn, Đặng Như Tại (1980), Cơ sở hóa học hữu cơ, Tập 2, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, tr.l33-
121.
15] Thái E>oân Tĩnh (2001), Giáo trình cơ sở lý thuyết hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.388-396.
[16] Trung tâm Quốc gia biên soạn từ điển Bách khoa Việt Nam (1991),
Bách khoa thư bệnh học,1.1, tr.201-209.
[17] Vũ Ngọc Thúy, Tào Duy Cần (1989), Thuốc và cách sử dụng, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.440,446.
Tiếng Anh
[18] Ạ c . Barrios Sosa, K. Yakushijin, D. Ạ Home (2002), “Synthesis of axinohydantoins”, J. Org. Chem. 67,4498 - 50CX).
[19] Ạ Hubele (1982), “Imidazolidin-2,4-dione derivatives, process for their preparation and their microbicidal application”, c . Ạ vol 96, 162700n.
[20] Ạ Joule, G. s. Smith (1978), Heterocyclic Chemistry, published by Van Notrand Cọ Ltd., England, edition. Chapter 19.
[21] Ạ Kleeman, T. Lusullbug, W. Pfeifer, D. Scherberich (1982) “Process for the Production of 5-Aryliden Hydantoins”, ỤS. Patent 4.305.072.
[22] C. Takayama (1981), “ l-Acyl-3-(3,5-dihalogenophenyl) hydantoin, its preparation, and fungicide comprising it as active ingredient”, C. Ạ vol 95,
25062W.
[23] D. Leone (2001) “Synthesis and chromatography o f [RuCpr-labelled diaryl ether peptoids as precursors o f the bastadins from the margin sponge lanthella basta ”, Dissertation for the degree of doctor of natural Sciences, Ruberto-Carola Universiti of Heidelberg, Germanỵ
[24] Ẹ Szymanska, K. Kiec-Kononowicz, Ạ Bialecka, Ạ Kasprowicz (2002) “Antimicrobiai activity of 5-arylidene aromatic derivatives of hydantoin”, II Farmaco 57, p.39-44.
[25] Ẹ Szymanska, K. Kiec-Kononowicz (2002), “Antimycobacterial activity of 5-arylidene aromatic derivatives of hydantoin”, II Farmaco 57, p.355-362,p.909-916.
[26] Ẹ Ware (1950), “Bucherer - Berg reaction”, Chem. Rev. 46,422.
27] G. Billek (1962) “ Condensation of aromatic aldehydes with hydantoin”, C. Ạ Vol 56, 394b.
28] H. Ạ Lehr, J. P. Zimmer, C. Hübner, M. Ballmann, W. Hatchmann, W. Vogel, H. Baisch, P. Hanter, ]VỊ Albani, Ạ Kohlschütter, H. Schmitz (1990) “Decreased binding of HIV-1 and vasoactive intestinal peptide following plasma membrane fluidization of cells by phenytoin”.
Virology 179, p.609-617.
[29] H. F. Chan (1988), “Substituted 2,4-imidazolidindiones and fungicidal aompositions”, C. Ạ vol 108, 129020ẹ
[30] H. W. Bond (1948) “Synthesis of carrboxyl-labelled tryptophan from hydantoin containing isitopic carbon”, / . Biol. Chem. 175,531.
[31] J. F. C, Albuquerque, J. Ạ Rocha Filho, S. S. F Brandao, M. C. Ạ Lima, Ẹ Ạ Ximenes, S. L. Galdino, Ị R. Pitta, C. Luu-Duc, J. Chantegrel, M. Perrissin (1999), “Synthesis and antimicrobial activity of substituted imidazollidindiones and thioxoimidazolidinediones”, 11 Farmaco 54, p.77- 82.
[32] J. Iwao, K. Tomino (1956), “ Convenient synthesis of 5-subtituted hydantoins and rhodanins”, J. Pharm. Soc. Japan 76, p.755.
[33] J. Marten, J. Enisz, S. Hostafi, and T. Timar (1993) “Preparation and fungicidal activity of 5-subtistuted hydantoin and their 2-thio analogs”, / .
Argic. Food Chem. 41, 148-152.
[34] K- Kiec-Kononowicz, Ẹ Szymanska, M. Motyl, Ạ Kasprowicz, Ạ Bialecka, W. Holzer (1998) “Synthesis, spectral and antimicrobial properties of 5-arylidene aromatic derivatives of imidazoUdine-2,4-dione”, Pharmazie
53,p.680-684.
[35] K. M. Ghoneim, F. El-Telbany, M. Ạ Ismal (1987), “Hydantoin and thiohydantoin derivatives as potential antimicrobial agents”, Egypt. J. Pharm. Scị 28, p.77-86.
[36] K. Othme (1966), Encyclopaedia o f chemical technology, 2"^* edition, voLl,p.l41-164.
[37] M. C. Ạ Lima, D. L. Costa, Ạ J. Goes, S. L. Galdino, Ị R. Pitta, C. Luu-Duc (1992), “Synthesis and antimicrobial activity of chlorobenzyliden imidazollidindiones derivatives and substituted thioxoimidazolidinediones”,
Farmazie 47, p. 182-184.
[38] M. Lamothe, M. Lannuzel, and M, Perez (2002), “Solid-phase preparation of hydantoins throught a new cychzation/cleavage step”, J. Com. Chem. 4, p.73-78.
[39] M. Matsukura, Ỵ Daiku, K. Ueda, s. Tanaka, T. Igarashi, N. Minami (1992) Chem. Pharm. Bull. 40, 1823, 1992.
[40] P. Chemla (1993), Tetrahedron letter, 34, 7391.
[41] R. Jakse, V, Kroselj, s. Recnik, G. Sorsak, J. Svete, B. Stanovnik, and S. G. Grdadolnik (2002) “Stereoselective synthesis o f 5-[(Z)- heteroaryỉmethylidene] substituted hydantoins and thiohydantoins as Aplysinopsin analogs”, z Naturaforsch. 57b, p.453-459.
[42] R. M. Silverstein, G. c . Bassler, J. c . Morrel (1981), Spectrometric identification o f organic compounds, 4‘^ edition, John Wiley, NewYork. [43] R. N. Comber et al. (1992), “5,5-disubtituted hydantoin: Synthese and Anti-HIV activity”, J. Med. Chem., 35, 3567-3572.
[44] S. B. Mirviss, s. K. Dahod, and M. w . Empie (1990), “Synthesis of L- Phenylalanine Methyl Ester”, Ind. Eng. Chem. Res. 29, p.651-659.
[45] s, B. Mirviss (1986) “Synthesis of unsaturated Hydantoins with an inexpensive catalyst”, JJ.S. Patent 4.582.903.
[46] S. M. M. Zaidi, R. K. Satsangi, p. Nasir, R. Agarwal, s. s. Tiwari (1980), “New anti-mycobacterial hyám ĩóm s'\ Pharmazie 35, p.755-756. [47] T. Dylag et.al (2004), “Synthesis and evaluation of in vivo activity of diphenylhydantoin basic derivatives”, Eur. J. Med. Chem., 39, 1013 - 1027. [48] The Merck Index (2001), published by Merck & Cọ Inc., 13''^ edithion, p. 850, 1534.
Tiếng Pháp
[49] D. L. Barros Costa, C. Lud-duc (1995) “Imidazolidindiones et thiazolidindiones substituées; Synthèse, étude structurale et activité cytotoxique”, J. Pharm. Belg. 50, p.5-7.
[50] H. Ạ Lerh, J. P. Zimmer (1986), “Diphenylhydantoin zur prophylaxe und therapie von AIDS”, DMW, Dtsch. Med. Wochenschr. 111,1001-1002.
PHỤ LỤC Hình 1 Phổ IR của chất (I) Hình 2 Phổ IR của chất (H) Hình 3 Phổ IR của chất (ni) Hình 4 Phổ IR của chất (IV) Hình 5 Phổ IR của chất (V) Hình 6 Phổ IR của chất (VI)