2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (SKLM).
Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM trên bản mỏng Kiesegel 6OF254 (Merck). Các chất (I-VII) được hòa tan trong dung môi aceton.
Chúng tôi đã chọn được các dung mối thích hợp để làm hệ triển khai sắc ký:
+ Hệ 1: n-hexan : aceton ( 1 : 1 ) + H ệ2:CHCl3: M e O H (1 0 : l )
Kết quả sắc ký cho thấy các chất thử đều hiện vết gọn, rõ khi soi dưói đèn tử ngoại bước sóng 254 nm, như trình bày dưới bảng sau:
Bảng 3: Tóm tắt kết quả SKLM
Chất Hệ dung môi khai triển R
PPl PP2 I Hệ 1 0,73 0,73 II Hệ 1 0,75 0,75 m Hệ 1 0,64 .. . IV Hệ2 0,57 .. . V Hệ 2 0,72 0,72 VI Hệ 1 0,53 0,53 vu Hệ 1 0.55 0,55 2.3.2 Phân tích phổ hồng ngoại (ỈR).
Tại phòng thí nghiệm Trung tâm (Trường đại học Dược Hà Nội), 7 mẫu (I-VII) đã được ghi phổ hồng ngoại trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-500 cm'*, 7 phổ đã được ghi ở hình 1-7.
* Biện giải phổ hồng ngoại:
Bẩy chất (I-VIĨ) do chúng tôi tổng hợp được có hàng loạt nhóm chức và liên kết như NH, > 0 0 , > c= c< , nhân benzen, NCH3, CH3,...
Phân tích phổ đồ của các chất tổng hợp được cho phép chúng tôi nhận biết các giải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức và các liên kết điển hình của các chất nghiên cứụ
Kết quả biện giải được ghi ở bảng 4, Các số liệu phù hợp với các tài liệu
Các kết quả biện giải đã chứng tỏ cấu trúc của các chất tổng hợp được đúng như dự kiến.
Về mối liên quan cấu trúc - phổ hổng ngoại, chúng tôi có một số nhận xét sau đây:
+ Bẩy chất (I-VII) có các dải hấp thụ của các yếu tố cấu trúc chung như — NH, > c = 0 , > c= c< , nhân benzen.
+ Hai chất III, IV có dải hấp thụ ở các tần số 1530^1524 cm * và
1540-Ỉ-1539 em ', đặc trưng cho các dao động hóa trị bất đối xứng (v^^) và
dao động hóa trị đối xứng ( v j của nhóm -N O2 có mặt trong cấu trúc của hai chất nàỵ
+ Hai chất VI, VII có các dải hấp thụ ở các tần số 341CN-3354 cm đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm -O H phenol có mặt trong hai chất nàỵ
+ Hai chất V, VII có các dải hấp thụ ở tần số 1448-^1440 em'' và
1382-^1379 cm đặc trưng cho dao động biến dạng bất đối xứng và dao
động biến dạng đối xứng (ô,) của nhóm -C H3 có mặt trong hai chất nàỵ + Chất II có dải hấp thụ ở tần số 1093 cm**, đặc trưng cho nguyên tử clo liên kết trực tiếp với nhân thcfm ở vị trí parạ
Bảng 4: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR, cm Chất Vnh ''oH arom ''oCH3 arom ''c=o ^c=c V G^-C arom ''n02 arom ô CH3 ôC-H (benzen) I 3231 1770 1717 1654 1540 1507 1455 1253 1Ỉ97 771 695 u 3227 1796 1735 1664 1580 1491 1253 1196 824 111 3268 1771 1715 1664 1560 1455 1524(v,,) 1340(v,) 1208 1109 809 IV 3329 1770 1743 1662 1580 1504 1530(V,J 1339(vJ 1248 1190 874 V 3178 1760 1727 1657 1520 1448 1448(ỗ,,) 1382 (ÔJ 1263 1191 824 VI 3164 3354 1751 1713 1667 1603 1454 1248 1193 770 vn 3158 3410 2758 1752 1710 1654 1592 1515 1440 1440(Ô,J 1379(5J 1129 879 1242 813
2.3.3 Phân tích phổ tử ngoại (UV/VIS):
Tại phòng thí nghiệm trung tâm ưường Đại học Dược Hà Nội, 7 chất (I- VII) đã được ghi phổ tử ngoại trên máy Cary-IE UV-Visible Spectrophotometer Varían, dung môi ethanol, nồng »20 ^g/ml.
Các giá trị được ghi ở bảng 5, các phổ đồ ghi ở các hình 8-14. Kết
quả thu được phù hợp với các tài liệu tham
Bảng 5: các chất I-VII C hất (nm) I 228 308 316 II 227 321 III 215 307 314 IV 236 348 V 203 240 386 VI 205 235 2 1 2 341 VII 204 237 347
Nhận xét về mối liên quan cấu trúc — phổ tử ngoại:
+ Các chất tổng hợp được hấp thụ mạnh ở vùng tử ngoại đặc trưng cho
cấu trúc phân tử có hê liên họfp K—71 (nhân benzen, nhóm > c = c ~ c = 0 ) .
+ ở các vùng 203 — 205 nm và 215 — 240 nm được quy cho chuyển
+ ^ các vùng 308 — 321nm và 341 — 386 nm được quy cho chuyển
mức năng lượng 7T— 7Ĩ* của hệ liên hçfp toàn phân tử.
+ Có thể nhận xét 2 chất đồng phân III và IV có cùng nhóm th ế — NO2 ở
vòng benzen nhưng của chất III (314 nm) nhỏ hơn của chất IV (348
nm). Điều này có thể giải thích là à chất IV, nhóm —NO2 ở vị trí para so
với nhóm >c=c—c = 0 nên hệ liên hợp toàn phân tử dài hoín so với chất III có nhóm — N0 -, b vị trí meta chỉ liên họrp với vòng benzen mà không có sự
liên hçfp tiếp theo với nhóm >C“ C—c = 0 .
+ Phổ đồ các chất V, VI, VII cho ta thấy dịch chuyển về phía bước
sóng dài rõ rệt so với chất I (386, 341, 247 nm so với 316 nm). Có thể giải
thích là do sự có mặt của các nhóm trợ màu (— N(CH3),, — OH ) ở vị trí para
và ortho so với nhóm >c=c—0 0 đã kéo dài hệ liên hợp toàn phân tử, trong số đó nhóm — NíCHg), (ở chất V) thể hiện ảnh hưởng mạnh nhất = 386
nm) do hiệu ứng +M của nhóm này mạnh hơn so với nhóm — OH (ở chất VI,
VII).
+ Đối với chất II (có nhóm thế C1 à vị trí para), chuyển dịch nhỏ vé
phía sóng dài so với chất I (321 nm so với 316 nm), sự chuyển dịch này ít
hcfn nhiều so với các chất V, VI, VII đã nêu trên là do nguyên tử clo vừa có
hiệu ứng +M, vừa có hiệu ứng —I nên ít ảnh hưởng đến sự chuyển dịch điện
2.3.4 Phân tích phổ khối lượng (MS).
Phổ khối lượng được ghi trên máy HP-5989-MS tại phòng Phân tích cấu ưúc, Viện Hóa học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam).
Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành ghi phổ của 4 chất (I, III, V và VI).
Phổ đồ được ghi ở các hình 15-18. Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất I, ni, V, VI đều có pic phân tử, có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến. Ngoài ra phân tích phổ đồ cho phép nhận biết các pic phân mảnh của bốn chất này phù hçfp với sơ đồ phân mảnh và phù hợp với các tài liệu tham khảo
Bảng 6: Số liệu khối phổ của chất I và chất VỊ
Chất Cống thức cấu tạo m/z I í ó M = 18i8 188 (M") 1 1 7 (M ^ -H N C 0 -C 0 ) 90 0 1 7 -H C N ) 63 (90- C 2H2- IH) III A ^ HN ì M = 233 N O 2 233 (MO 162 (M^ - HNCO - CO) 1 1 6 (1 6 2 -N 0 2 ) 89 Ù 1 6 -H C N ) 63 (8 9 -C ,H ,) V o H T ị [ o M = 231 . N ( C H 3 ) 2 231 (M+) 160 (M ^-H N C O -C O ) 1 1 6 a 6 0 - N ( C H 3 ) 2 ) 89 (116-H C N ) 6 3 (8 9 - Q H 2 ) VI o Ịítì M = 204, 0H 204 (M^) 187 (M -O H ) 161 (M -H N C O ) 133 0 6 1 - CO) 106 0 3 3 - H C N ) 78 Ò 0 6 -C O )
Sơ đồ phân mảnh của chất V: o (CH3)2N- \ \ / / -CH=C=NH + m/z 160 - k c H ^ h m/z 116 - H C N 1r m /z 89 C5H3 m/z 63
2.4 Thử hoạilỉháng dòng tê bào ung thư ngưòị
Một số công trình trên thế giới và trong nước đã công bố kết quả thử hoạt tính chống tế bào ung thư của một số dẫn chất của Các kết quả đó đã định hưdíng chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tí
dòng tế bào ung thư người của một số đẫn chất của hydantoin do chúng tôi tổng hợp với mong muốn góp phần tìm kiếm các thuốc chống ung thư.
2.4.1 Nguyẽn tác
Tiến hành theo phưcmg pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
Dòng tế bào nghiên cứu:
+ Hep-2: Tế bào ung ũiư gan ở ngườị + LU: Tế bào ung thư phổi ở ngườị
2.4.2 Tiến hành
Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện ở phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện Khoa học và công nghê Việt Nam theo quy ưình sau đây:
Tế bào ung thư được duy trì liên tục ở điểu kiện chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log, sẽ được sử dụng cho test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4-10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lẩn trên vi lượng 96 giếng trong dung môi dimethylsulfoxyd (DMSO) 10%.
Phiến thử nghiệm được ủ trong tủ Ễ&n C02/37°C/48-72h để tế bào tiếp tục phát triển, bao gồm: Tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử. Sau đó lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hòa lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa, bước sóng 495-515nm.
Nồng độ ức chế tế bào ung thư của chất thử được tính bằng giá trị IC50. Giá trị này được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarid dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị mật độ quang (optical density - OD) đo được.
Các mẫu chất tinh khiết có giá trị IC50 <5 Ịig/ml được coi là có hoạt tứửị Kết quả thử nghiêm được ghi ở bảng sau:
Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư ngưòí của các chất thử.
STT Chất
Dòng tế bào - Giá trị IC50
(^g/mI) Kết luận Hep-2 1 I >5 >5 Am tính 2 II 0,65 >5 Dương tính 1 dòng 3 m 3,07 >5 Dưcmg tính 1 dòng 4 IV 4,56 >5 Dưctng tính 1 dòng 5 V 0,54 >5 Dương tính 1 dòng 6 VI >5 >5 Am tứứi 7 vn >5 >5 Am tính 2.5 Bàn luận 2.5.1 Về tổng hợp hóa học
* Đã khảo sát, so sánh 2 phương pháp ngưng tụ các aldehyd thơm với hydantoin là: dùng xúc tác AcONa trong AcOH (PPl) và dùng diethanolamin vừa làm xúc tác vừa làm dung môl (PP2) để tìm điều kiện phản ứng thích hợp cho hiệu suất caọ
* Kết quả thực nghiêm cho thấy:
+ Phản ứng tổng hợp chất (I) (dùng benzaldehyd) và chất (II) (dùng p- clorobenzaldehyd) theo 2 phương pháp cho hiệu suất gần như tưcfng đương nhau, tuy nhiên phương pháp 2 cho thời gian phản ứng ngắn hcfn rõ rệt-
+ Phản ứng tổng hợp 3 chất (V), (VI), (vn) vód các hợp phần aldehyd lần lượt là p-dimethylaminobenzaldehyd, aldehyd salicylic, vanillin có hiệu suất
phản ứng theo phưcmg pháp 2 cao hcfn rõ rệt so với phưcíng pháp 1
(80,73%-ỉ-50,69% so với 8,97%^3,24%). Thời gian phản ứng theo phưcíng
pháp 2 cũng ngắn hơn hẳn ( 1 0 phút so với 6-^7 giờ).
+ Phản ứng tổng hợp 2 chất (HI), (IV) với các aldehyd là meta và paranitrobenzaldehyd không thực hiện được theo phucfng pháp 2. Phưcỉng pháp 1 cho hiệu suất phản ứng như các tài liệu đã công
* Có thể giải thích các kết quả thực nghiêm như sau:
+ Xúc tác diethanolamin là một tác nhân nucleophilic mạnh đã hoạt hóa nhóm methylen của hydantoin mạnh hơn nhiều so với NaOAc/AcOH (xúc tác này có tính nucleophilic yếu), do đó carbanion của hydantoin tạo thành nhiều hcfn và tấn công vào họfp phần aldehyd cũng mạnh hcfn. Kết quả là thời gian phản ứng khi dùng xúc tác này ngắn hơn hẳn so với khi dùng xúc tác NaOAc/AcOH trong các phản ứng tổng hợp 5 chất (I, n, in, IV, V).
+ Đối với phản ứng tổng họfp 2 chất (I) và (II), độ bền của ion alcolat trung gian ứng với benzaldehyd và p-clorobenzaldehyd ít chịu ảnh hưỏng của môi trường phản ứng do đó hiệu suất thu được là tương đương nhau ở cả hai phưoíng pháp.
+ Đối với phản ứng tổng hçfp 3 chất (V), (VI) và (VII), do sự tấn công với sô' lượng nhiều hofti của các carbanion của hydantoin và thuận lợi về mặt nâng lượng nhờ các nhóm đẩy điện tử có trong các aldehyd thom, do đó các ion alcolat trung gian được tạo thành nhanh hơn và bền hofn trong môi trường kiềm mạnh (diethanolamin), vì vậy phưcmg pháp 2 cho hiệu suất cao hoín hẳn và thời gian phản ứng ngắn hcín rõ rệt so với phưcmg pháp 1.
+ Đối với phản ứng tổng hợp 2 chất (m ) và (IV), có lẽ trong môi trường kiềm mạnh (diethanolamin) và nhiệt độ cao (HÓ^C), các ion alcolat có chứa nhóm hút điện tử mạnh là “NO2 tạo thành rất không bền, do đó phản ứng không thực hiện được theo phưmg pháp 2. Ngược lại trong môi trường acid
acetic, pH acid kết hợp với hiệu ứng hút điện tử manh của nhór, hoạt hóa nhóm aldehyd do đó hiệu suất phản ứng tổng hợp hai ch (IV) theo phưcíig pháp 1 tưang đối caọ
2.5.2 Về xác định cấu trúc
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ đã kết luận cấu trúc của các chất tổng hợp được đúng như dự kiến.
2.5.3 Về tác dụng sinh học
* Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư theo người cho thấy trong số 7 dẫn chất 5-arylidenhydantoin tổng họip được, có 4 chất có tác dụng (n, rũ , rv , V) trong đó hai chất II và V có tác dụng rất mạnh (giá trị IC50 là 0,65 và 0,54 |ag/ml). Ba chất I, VI, VII không có tác dụng.
+ Kết quả trên cho thấy dẫn chất 5-aryliđenhydantoin có tiềm năng kháng tế bào ung thư rất đáng quan tâm.
Về mối ỉỉên quan cấu trúc - tác dụng chống ung thư, có thể nhận xét như
sau: ^
+ Các nhóm thế ở nhân thcfm của hợp phần aldehyd có ảnh hưởng đến hoạt tính chống ung thư của các chất như kết quả đã trình bày ở trên.
+ Có thể giả thiết rằng các nhóm thế đã ảnh hưởng đến độ phân cực của
liên kết c = c trong nhóm carbonyl a-P không no có trong phân tử. Đây là yếu tố cấu trúc có thể phản ứng với các chất ái nhân sinh học (có chứa nhóm thiol, amin) làm rối loạn chuyển hóa acid nucleic dẫn tới thay đổi hình thái nhiễm sắc thể của nhân tế bào đang phân chia dẫn tới tác dụng chống ung thư.
+ Ngoài các yếu tố cấu trúc nêu trên, chúng tôi cũng hiểu rằng tác dụng chống ung thư và các tác dụng sinh học khác thu được phụ thuộc vào cấu trúc và các tính chất hóa lý của toàn phân tử.
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1 Kết luận
1. Chúng tôi đã tổng hợp được 7 dẫn chất 5-arylidenhydantoin (I-VII)
trong đó 2 chất (IV,V) chưa thấy trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo
được.
2. Đã khảo sát phản ứng ngưng tụ của hydantoin với một số aldehyd thơm
theo hai phưoíng pháp (dùng xúc tác NaOAc khan trong AcOH băng và dùng
diethanolamin làm XÜC tác và dung môi). Kết quả cho thấy với các aldehyd
thơm có nhóm thế đẩy điện tử thì phưcfng pháp dùng diethanolamin làm xúc
tác và đung môi cho hiệu suất cao hcfn hẳn và thời gian phản ứng ngắn hơn
rõ rệt so với phương pháp dùng xúc tác NaOAc khan trong AcOH băng.
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM, xác
định cấu trúc bàng phổ hổng ngoại, phổ tử ngoại và khối phổ. Kết quả cho
phép chúng tôi kết luận các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự
kiến.
4. Đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư của bẩy chất tổng hcfp được
(I-^VII) đối với 2 dòng tế bào ung thư ở người là tế bào ung thư gan (Hep-2)
và tế bào ung thư phổi (LU), Kết quả cho thấy bốn chất (II, III, IV và V) có
tác dụng ức chế chọn lọc dòng tế bào Hep-2, trong đó hai chất (II và V) có
và chất V). Ba chất I, VI và vn không có tác dụng trên hai dòng tế bào đã thử.
3.2 Đề xuất
+ Về tổng hợp hóa học: Cần tiếp tục khảo sát và tìm các điều kiện phản
ứng tối ưu cho từng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel của hydantoin với các
aldehyd thcrm để đạt được hiệu suất và hiệu quả kinh tế cao nhất.
+ Về tác dụng sinh học: Cẩn tiếp tục khảo sát sâu hơn về hoạt tính chống
ung thư của các dản chất dãy 5-arylidenhydantoin với hy vọng tìm ra các