CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Tạo các quẩn thể hồi giao chuyển gen chống chịu mặn trên cây lúa
3.2.3.2. Kết quả đánh giá các quần thể BC1 trên OM1490/Pokkali//OM1490
Khuếch đại DNA bằng phƣơng pháp PCR - SSR với marker RM223 Quần thể lai OM1490/Pokkali//OM1490 đƣợc kiểm tra với chỉ thị RM223
Kết quả phân tích điện di trên chỉ thị RM233 trên 50 dòng BC1 ghi nhận cho thấy các cá thể ở vị trí số: 60, 61, 63, 64, 66 có cùng kiểu kích thước với Pokkali mang gen kháng mặn. Dị hợp tử chiếm khá cao 30 dòng trên quần thể tương ứng với kích thước 220bp và 200bp (Hình 3.17).
Khuếch đại DNA bằng phƣơng pháp PCR - SSR với marker RM3252-S1-1
Đối với chỉ thị phân tử RM3252-S-1-1, kết quả ghi nhận trên hình của quần
thể BC1 có 4 cá thể có cùng kích thước với Pokkali mang gen kháng mặn tương ứng ở vị trí số 1, 28, 32, 48. Có cùng kích thước với OM1490 có 25 cá thể ở vị trí số 2, 3, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46
Hình 3.17. Sản phẩm PCR của các giống lúa cao sản tại locus RM223 liên kết với gene kháng mặn trên nhiễm sắc thể số 8, vị trí hai băng 220bp và 200bp,
trên gel agarose 3%.
Ghi chú: M: 100bp DNA ladder;1: OM1490 - 200bp, 2: Pokkali - 220bp, 1-50 là cây lai BC1
200 bp 220 bp
và 47. Có 2 cá thể khơng xuất hiện băng hình tương ứng ở vị trí số 37 và 42. Các cá thể cịn lại có kiểu gen dị hợp tử mang gen kháng mặn và không kháng mặn tương ứng vị trí số 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 29, 30, 31, 49 và 50. Như vậy tiếp tục chọn 25 cây nầy để cho lai tiếp cho thế hệ BC2F1.
Kết quả tạo hạt hồi giao lần thứ nhất (BC2) cho các quần thể OM1490/Pokkali//OM1490
Đối với các dòng BC2 của tổ hợp lai OM1490/Pokkali//OM1490, ghi nhận có rất nhiều dòng BC2 chứa gen chống chịu mặn được liên kết với marker RM3252- S1-1, một số dòng biểu hiện dị hợp tử (Hình 3.18). Một số dòng chứa gen chống chịu mặn liên kết với marker RM223, có 2 dịng trong tổng số biểu hiện dị hợp tử với marker RM223 (Hình 3.19).
Hình 3.18. Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM 3252-S1-1 trên 50 dòng liên kết với gene kháng mặn trên nhiễm sắc thể số 1, vị trí hai băng 220bp và
230bp, trên gel agarose 3 %.
Ghi chú: M: 50bp DNA ladder; 1: Pokkali – 230bp, 2: OM1490 – 220bp: 1-50 là cây lai BC2
230bp
220bp 230bp
Kết quả tạo hạt hồi giao lần thứ nhất (BC3) cho các quần thể OM1490/ Pokkali//OM1490
36 dòng BC3F2 của quần thể lai hồi giao OM1490/Pokkali//OM1490 được khuếch đại gen mặn bằng phương pháp PCR với chỉ thị RM3252-S1-1 (liên kết với gen Saltol trên NST1) và RM223 (liên kết với gen mặn trên NST8). Với chỉ thị RM 3252-S1-1, các băng hình của các dịng được ghi nhận có sự đa hình trên gel agarose 3%. Pokkali, mang gen mặn, thể hiện băng có kích thước là 230bp và OM1490, không mang gen, thể hiện băng có kích thước 220bp. Qua đánh giá kiểu gen, 1 dòng mang gen chịu mặn bao gồm dịng số 1, cùng kích thước băng hình với Pokkali (Hình 3.20).
Hình 3.19. Sản phẩm PCR của 36 dịng hồi giao BC2 của OM1490/Pokkali//OM1490 liên kết với marker RM223
Ghi chú: M: 100bp DNA ladder. Sản phẩm được chạy điện di trên agarose 3% và gel này được nhuộm với ethidium bromide 0.5mg/ml và phân tích bằng thiết bị Alpha Imager
1220 (Alpha Innotech, CA, USA)
220bp
230bp 230bp
Hình 3.20. Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM3252-S1-1 trên 36 dòng BC3F2 của quần thể OM1490/ Pokkali//OM1490 trên gel agarose 3%.
Ghi chú: M: 100bp DNA ladder, 1: OM1490 – 220bp, 2: Pokkali – 230bp
Đới vối RM223, sản phẩm PCR thể hiện sự đa hình với các kích thước 200 và 220bp. Pokkali, mang gen mặn, thể hiện băng có kích thước là 220bp và OM1490, không mang gen, thể hiện băng có kích thước 200 bp. Các dòng mang gen mặn được đánh giá bao gồm: dòng số 33 – 43, 45, 46 và dòng số 48-50 mang cùng gen với giống Pokkali. Các dịng cịn lại có băng hình dị hợp tử và đồng hợp với kích thước là 200bp, giống với vị trí băng hình của OM1490.
Hình 3.21. Sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử RM223 trên 53 dòng BC3F2 trên quần thể OM1490/Pokkali//OM1490 trên gel agarose 3%.
Ghi chú: M: là marker chuẩn, 1: Pokkali – 220bp, 2: OM1490 – 200bp
220bp 220bp
220bp
Qua đánh giá kiểu gen, các dòng thể hiện mang gen mặn khi đánh giá với cả hai chỉ thị RM3252-S1-1 và RM223. Các dòng tiềm năng mang gen mặn này được sử dụng cho các nghiên cứu cho sự phân ly tiếp theo.
Tóm lại: Trên tổ hợp OM1490/Pokkali//OM1490 hồi giao ghi nhận
Ở thế hệ F1, 210 cá thể được thu hoạch. Kết quả đánh giá bằng chỉ thị phân tử RM233 có 70% cá thể mang gen saltol dị hợp tử. Kết hợp đánh giá kiểu hình những cá thể ưu thế sẽ được chọn để lai tạo cho thế hệ sau.
Ở thế hệ BC1F1, thu hoạch được 50 cá thể ưu tú nhất. Trong đó, 29 cá thể thể hiện gen saltol dị hợp tử, chỉ có 5 cá thể (BC1F1-10, BC1F1-11, BC1F1- 13, BC1F1- 14 và BC1F1-16, được chọn vì mang cả gen saltol trên nhiễm sắc thể số 8. Riêng trên nhiễm sắc thể số 1 ghi nhận có 4 dòng mang gen mặn (BC1F1-1, BC1F1-28, BC1F1-32 BC1F1-48. Như vậy nếu chọn kết hợp hai chỉ thị chỉ chọn được 9 dòng cho gen mặn.
Ở thế hệ BC2F1, 124 cá thể được đánh giá kiểu gen với chỉ thị gen saltol, tuy
nhiên chỉ có số 7, số 30 và dòng số 36, 47 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử (200- 220bp). Các cá thể này được đánh giá tiếp tục với các chỉ thị tái tổ hợp. Hầu hết các cá thể đều mang gen chịu mặn. Do đó chọn ngẫu nhiên 3 dịng BC2F1-7, BC2F1-30, BC2F1- 36 trồng tiếp để lai hồi giao tạo quần thể BC3.
Ở thế hệ BC3F2, có 35 cá thể dị hợp tử gen trong tổng số 50 cá thể được thu hoạch. Qua đánh giá gen tái tổ hợp, chọn được cá thể (BC3F2-2 đến BC3F2-32) mang cả gen chống chịu mặn.