3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.1. Tạo cây A thaliana chuyển gen
Hình 2.3. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen
Gieo và chăn sóc trong điều kiện ngày ngắn đến khi ra hoa
Hút chân không trong 30 giây
Ly tâm thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch đồng nuôi cấy Hạt A. thaliana đã
được xử lý này mầm
Cây A. thaliana
nở hoa
A. tumefaciens được nuôi trong môi trường
YEP 48 giờ Dung dịch đồng nuôi cấy + vi khuẩn A. tumefaciens Hạt A. thaliana chuyển gen + Nhúng hoa trong 30 giây Trồng, chăm sóc trong nhà lưới tới khi có quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
Cây A. thaliana được trồng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ sáng/ 16 giờ tối) tới khi cây ra hoa. Sau đó, tiến hành chuyển gen vào hoa theo phương pháp nhúng hoa [14]. Hoa được ngâm trong dụng dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM, sucrose 5%) có OD = 0,8 trong 30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt trong bình kín 3 ngày. Cứ 6 ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín tiến hành thu hạt và xử lý này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo.
2.2.3.2. Đánh giá cây Arabidopsis chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ
Sau khi có được hạt cây A. thaliana chuyển gen đem gieo trên môi trường MS/10 có bổ sung phosphinothricin (PPT) 3 mg/l, theo dõi số cây sống, số cây chết từ đó đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7-cryIA(c).
2.2.3.3. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar mồi đặc hiệu của gen bar
Sau khi gieo hạt cây A. thaliana chuyển gen trên môi trường chọn lọc, những cây sống sót được chuyển ra bầu đất, chăm sóc đến khi ra hoa, tiến hành thu mẫu lá, tách ADN, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar để đánh giá sự tồn tại của gen bar trong cây chuyển gen
Thành phần phản ứng và chu kỳ phản ứng như sau Thành phần của phản ứng 50 µl bao gồm Nước khử ion 10X buffer 10X dNTP bar-F (10 pmol/µl) bar -R (10 pmol/µl) ADN khuôn (50 ng/µl) Taq polymerase 32,5 µl 5 µl 5 µl 2 µl 2 µl 3 µl 0,5 µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
38
Chu trình nhiệt cho phản ứng được đặt như sau 95oC trong 5 phút
95 oC 45 trong giây
55 oC 45 trong giây 30 chu kỳ 72 oC trong 60 giây
72 oC trong 7 phút
2.2.3.4 Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Sau khi đã tách được ADN cây chuyển gen, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) để đánh giá sự tồn tại của gen cryIA(c)
trong cây chuyển gen. Thành phần và chu kỳ phản ứng PCR tương tự như phần 2.2.1.1.
2.2.3.5. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen được bố trí ngẫu nhiên gồm 2 công thức, 3 lần nhắc lại (21 cây/ lần nhắc lại). Công thức 1: cây không chuyển gen (đối chứng), công thức 2: cây chuyển gen.
Chỉ tiêu theo dõi: thời gian sinh trưởng, số lá/ cây, số nhánh hoa/ cây, số hoa/ cây, số quả/ cây, tỷ lệ đậu quả, số hạt/ quả.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
39
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nhân dòng gen cryIA(c) từ vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c)
3.1.1. Kết quả nhân gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mut-cryIA(c)
Vectơ pOB-Mutant#16-cryIA(c) được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c), sau đó được điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Kết quả thu được ở hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả PCR gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mutant#16- cryIA(c)
Đường chạy đ/c: (đối chứng) PCR nước cất, đường chạy 2: sản phẩm PCR (gen cryIA(c)) từ vectơ pOB-Mutant#16- cryIA(c), đường chạy M: Ladder 1 kb của hãng Bioneer
Qua hình 3.1 cho thấy: Đường chạy số 2 có một băng ADN duy nhất kích thước khoảng 1,8 kb tương ứng với gen cryIA(c) (1,857 kb), bên cạnh đó đường chạy đ/c không có băng ADN được nhân lên. Điều này chứng tỏ đã nhân thành công gen cryIA(c) và sản phẩm phản này có thể dùng để gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng sau khi tinh sạch.
3.1.2. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vectơ tách dòng pENTR™/D-TOPO®. Sau khi nhân gen cryIA(c) bằng phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm này bằng bộ kit QIA quick gel extraction (Fermentas) và được gắn lên vectơ tách dòng pENTRTM/D-TOPO và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng
DH5α khả biến để nhân dòng. Các dòng khuẩn lạc chứa vectơ tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kanamycin100 mg/l .
2 kb M
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40
Kết quả nhân dòng được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả tác dòng gen cryIA(c) trong vi khuẩn E. coli
Hình 3.2 cho thấy: có 14 dòng khuẩn lạc có khả năng sống trên môi trường chọn lọc, điều này đồng nghĩa là 14 dòng khuẩn lạc này chứa vectơ tái tổ hợp pENTR-cryIA(c). Tuy nhiên, để khẳng định đoạn chèn đó là gen
cryIA(c), tiến hành phân tích vectơ có trong các dòng khuẩn lạc thu được bằng 2 phương pháp: PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) và xác định trình tự đoạn ADN được chèn vào.
3.1.3. Kết quả phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc
Các dòng khuẩn lạc trên được nuôi riêng trên các đĩa pettri, đồng thời thực hiện phản ứng PCR các dòng khuẩn lạc thu được với cặp mồi đặc hiệu của gen
cryIA(c). Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu được kết quả ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc sau nhân dòng
M: Ladder 1 kb; đ/c: gen cryIA(c) đem gắn lên vectơ pENTR (đối chứng); 1- 14 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 M đ/c 9 10 11 12 13 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
41
Hình 3.3 cho thấy: Trong 14 dòng khuẩn lạc, có 9 dòng (1, 2, 3, 4,6, 7, 8, 10, 12) tạo băng ADN có kích thước 1,8 kb, tương đương với gen cryIA(c)
(1,857 kb) và 5 dòng (5, 9, 11, 13, 14) không tạo ra băng kích thước 1,8 kb. Điều này cho thấy các dòng (1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12) có chứa gen cryIA(c).
3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng
Các dòng khuẩn lạc có chứa gen cryIA(c) được nuôi riêng trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin100 mg/l, sau đó thu cặn khuẩn, tách plasmid và xác định trình tự 2 chiều của đoạn chèn bằng phương pháp dideoxy cải tiến của Sanger. Trình tự 2 chiều của đoạn chèn được so sánh với trình tự gen cryIA(c) ban đầu và trình tự gen có trên ngân hàng gen. Kết quả thu được ở hình 3.4 và 3.5.
Qua hình 3.4 và 3.5 rút ra một số nhận xét sau:
+ Trình tự đoạn ADN được chèn vào và trình tự gen cryIA(c) hoàn toàn trùng khớp với độ tin cậy 99%. Điều này chứng tỏ đã nhân dòng thành công gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mutant#16- cryIA(c).
Score = 1818 bits (984) Expect = 0.0 Identities = 992/995 (99%) Gaps = 3/995 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 130 ATGGACAACAACCCAAACATCAACGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAA 189
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 ATGGACAACAACCCAAACATCAACGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAA 60
Query 190 GTTGAAGTACTTGGTGGAGAACGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTG 249
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 61 GTTGAAGTACTTGGTGGAGAACGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTG 120
Query 250 TCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGAGCTGGGTTCGTTCTCGGACTA 309 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 TCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGAGCTGGGTTCGTTCTCGGACTA 180
Query 310 GTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATT 369
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 181 GTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATT 240
Query 370 GAGCAGTTGATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTCGTTTG 429 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 GAGCAGTTGATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTCGTTTG 300
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
42
Query 430 GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGAT 489
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGAT 360
Query 490 CCTACTAACCCAGCTCTCCGCGAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCC 549
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 CCTACTAACCCAGCTCTCCGCGAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCC 420
Query 550 TTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTG 609
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 421 TTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTG 480
Query 610 TACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAA 669 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 TACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAA 540
Query 670 AGATGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATT 729
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 541 AGATGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATT 600
Query 730 GGAAACTACACCGACTACGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGT 789 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 601 GGAAACTACACCGACTACGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGT 660 Query 790 CCTGATTCTAGAGATTGGGTGAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTT 849 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 661 CCTGATTCTAGAGATTGGGTGAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTT 720
Query 850 TTGGACATTGTGGCTCTCTTCAGCAACTATGACTCCAGACGTTACCCTATCCGTACAGTG 909
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 721 TTGGACATTGTGGCTCTCTTCAGCAACTATGACTCCAGACGTTACCCTATCCGTACAGTG 780
Query 910 TCCCAACTTACCAGAGAAATCTACACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTC 969 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 781 TCCCAACTTACCAGAGAAATCTACACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTC 840 Query 970 CGTGGTATGGCCCAGAGGATCGAACAGAACATCAGGCAGCCACACTTGATGGACATCTTG 1029 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 841 CGTGGTATGGCCCAGAGGATCGAACAGAACATCAGGCAGCCACACTTGATGGACATCTTG 900
Query 1030 AACAGCATAACTATCTACACCGATGTGCACAGAGGATACTATTACTGGTCTGGACACCAG 1087
||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 901 AACAGCATAACTATCTACACCGATGTGCACAGAGGATACTATTACTGGTCTGGACACC-G 960
Query 1088 ATCACCGCCTCTCCAGTTGGATTCCTCCGGACCTG 1122
|||||||||||||||||||||||| ||||||||||
Sbjct 961 ATCACCGC-TCTCCAGTTGGATTC-TCCGGACCTG 994
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự xuôi chiều thu đƣợc với trình tự gen
cryIA(c) đƣợc cung cấp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
43
Score = 1779 bits (963) Expect = 0.0 Identities = 980/987 (99%) Gaps = 6/987 (1%) Strand=Plus/Minus
Query 145 TTAAAGATTGTACTCAGCCTCAAGAGTGGCAGTAACAGGAATGAACTCGAATCTGTCAAT 204
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1857 TTAAAGATTGTACTCAGCCTCAAGAGTGGCAGTAACAGGAATGAACTCGAATCTGTCAAT 1798
Query 205 GATCACTCCTGCAGTACCGCTGAAATTCCTAACACCCACGATGTTGCCCAATGAAGAAGT 264
||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1797 GATGACTCCTGCAGTACCGCTGAAATTCCTAACACCCACGATGTTGCCCAATGAAGAAGT 1738
Query 265 GAATGCGTTGGCACTTTCGAAGTAACCAAAATCGCTGGATTGAAGATTATCGAGTGAGGT 324
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1737 GAATGCGTTGGCACTTTCGAAGTAACCAAAATCGCTGGATTGAAGATTATCGAGTGAGGT 1678
Query 325 AGCAGTAGCTGGAACGGTGTTGGAGAAGATAGATGAATTGCCCCAGTTCACGTTAAGGTG 384
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1677 AGCAGTAGCTGGAACGGTGTTGGAGAAGATAGATGAATTGCCCCAGTTCACGTTAAGGTG 1618
Query 385 GATTGGGGTCACAGAGGCGTATCTAACCCTAACTCTGTATCTAGTAGATGTGGATGGGAA 444
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1617 GATTGGGGTCACAGAGGCGTATCTAACCCTAACTCTGTATCTAGTAGATGTGGATGGGAA 1558
Query 445 GTGGATAGGAACTTCGATGTAGCCTCTATTCTGAATGTTGTTGCCAGAGCTGTTAAGTCT 504
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1557 GTGGATAGGAACTTCGATGTAGCCTCTATTCTGAATGTTGTTGCCAGAGCTGTTAAGTCT 1498
Query 505 CACAAGATCTCCGCCAGTGAATCCTGGTCCGCTGATAACGCTTCCATTGAAAAGGAAGTT 564
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1497 CACAAGATCTCCGCCAGTGAATCCTGGTCCGCTGATAACGCTTCCATTGAAAAGGAAGTT 1438
Query 565 TCCCTTCACGGCAGGGATTTGAGTAATACTATCAGATGCGATGATGTTGTTGAACTCGGC 624
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1437 TCCCTTCACGGCAGGGATTTGAGTAATACTATCAGATGCGATGATGTTGTTGAACTCGGC 1378
Query 625 AGAACGGTGCTGCCAAGAGAAGGTAGGAGCTCTGATGATGCTCACGGAACTGTTGCTGAA 684 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1377 AGAACGGTGCTGCCAAGAGAAGGTAGGAGCTCTGATGATGCTCACGGAACTGTTGCTGAA 1318 Query 685 TCCGGAACGGAACATGGACACGTGGCTAAGCCTGTGGGAGAATCCAGCCCTGGGTGGCAC 744 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1317 TCCGGAACGGAACATGGACACGTGGCTAAGCCTGTGGGAGAATCCAGCCCTGGGTGGCAC 1258 Query 745 GCTGTTATCCTGTGGTGGGATCACGTCCAAGGAATCAACGGTTCCCCTCTGTCTGTAGAT 804 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1257 GCTGTTATCCTGTGGTGGGATCACGTCCAAGGAATCAACGGTTCCCCTCTGTCTGTAGAT 1198 Query 805 GGTGGATGGCAAGTTAGAAGAGGTTCCATAGGCGAACTCTGTTCCGTCAAGAACGAAAAG 864 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1197 GGTGGATGGCAAGTTAGAAGAGGTTCCATAGGCGAACTCTGTTCCGTCAAGAACGAAAAG 1138
Query 865 CTCCTGGTTGTTAGGACCGATATTGAAGGGTCTTCTGTACAAGGTGGAAGACAAGGTTCT 923
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 Query 924 GAAGATACCGAGTCCGGTGAGGCTAACGATACGTTGTTGTGGAGCGGCGTTTCCAGCGTT 983 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1077 GAAGATACCGAGTCCGGTGAGGCTAACGATACGTTGTTGTGGAGCGGCGTTTCCAGCGTT 1018 Query 984 TCCGAAGAGAGGAAAAGCAAACTCAGGTCCGGAGAATCCAACTGGAGAGGCGGTGATCTG 1042 ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1017 TCCGAAGAGAGGAAAAGCAAACTCAGGTCCGGAGAATCCAACTGGAGAGGCGGTGATCTG 958 Query 1043 GTGTCCAGACCAGTA-TAGTATC-TCTGTGCACATCGGTGTAGATAGTTATGCTGTTCA- 1099 ||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 957 GTGTCCAGACCAGTAATAGTATCCTCTGTGCACATC-GTGTAGAT-GTTATGCTGTTCAA 898 Query 1100 GATGTCCATCA-GTGTGGCTGCCTGAT 1125 ||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 897 GATGTCCATCAAGTGTGGCTGCCTGAT 871
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự ngƣợc chiều thu đƣợc và trình tự gen cryIA(c) đƣợc cung cấp
Query: trình tự ADN đoạn xen; Sbjct: trình tự ADN được cung cấp
+ Trình tự gen cryIA(c) được nhân dòng không trùng với bất cứ trình tự sẵn có nào trên ngân hàng gen, trình tự này tương đồng ở mức 96% với gen
cryIAc1 có mã số AY126450.1 trên ngân hàng gen (bảng 3.1). Như vậy gen
cryIA(c) sử dụng trong thí nghiệm là một gen đột biến và chưa được công bố trên ngân hàng gen.
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen đƣợc nhân dòng với trình tự gen trên ngân hàng gen
Accession Description Max
score Total score Query coverage E value Max ident
AY126450.1 Synthetic construct insecticidal protein (cryIAc1) gene
3086 3086 100% 0.0 96% Y09787.1 B. Thuringiensis cryIA(c) gene 2909 2909 100% 0.0 94% GU583853.1 Gosypium hirsutum transgenic cultivar
Xinmian 33B insect-resistant
2543 2543 99% 0.0 91% GU583854.1 Gossypium hirsutum transgenic cultivar
GK-12 insect-resistant gene
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45
3.2. Kết quả tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-
cryIA(c)
3.2.1. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vectơ chuyển gen pB2GW7
Sau khi chọn lọc các dòng tế bào mang gen cryIA(c) tiến hành nuôi riêng, tách plasmid, thực hiện phản ứng LR để gắn gen cryIA(c) lên vectơ chuyển gen pB2GW7, sau đó biến nạp hệ thống vectơ tái tổ hợp này vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt [54]. Vi khuẩn mang vectơ tái tổ hợp pB2GW7- cryIA(c) được chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/lit. Theo lý thuyết, sau khi tiến hành chuyển gen lên vectơ pB2GW7 sẽ tạo ra 4 sản phẩm, tuy nhiên chỉ có 1 sản phẩm là kết quả gắn giữa gen cryIA(c) và vectơ pB2GW7 sống sót, còn tất cả các sản phẩm khác đều chết trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc. Kết quả chuyển gen được thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả gắn gen cryIA(c) lên vectơ pB2GW7
Qua hình 3.6 cho thấy: Đã chọn lọc được 247 dòng khuẩn lạc có khả năng kháng spectinomycin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
3.2.2. Kết quả phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc
Để kiểm tra sự tồn tại của gen cryIA(c) trong tế bào vi khuẩn E. coli sau chọn lọc, tiến hành chọn ngẫu nhiên 9 dòng khuẩn lạc, nuôi riêng trong môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, thu sinh khối, tách plasmid và thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu của gen cryIA(c), điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết PCR kiểm tra 9 dòng khuẩn lạc với mồi đặc hiệu của gen
cryIA(c)
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 9 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
Qua hình 3.7 cho thấy: Các đường chạy số 1 đến số 9 đều có 1 băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước gen cryIA(c) (1,857 kb) trong khi đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất hiện băng đặc hiệu, kết luận 9 dòng đem phân tích đều có chứa gen cryIA(c).
Hình 3.8. Sơ đồ cấu tạo vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c)
A
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
47
Theo lý thuyết: trong gen cryIA(c) và vectơ pB2GW7 đều có 1 vị trí nhận biết của enzym SacI. Do vậy, khi cắt vectơ tái tổ hợp này bằng enzyme
SacI sẽ tạo 2 băng ADN có kích thước lần lượt là 8,741 kb và 2,547 kb.
Để chứng minh việc gắn gen cryIA(c) lên vectơ không làm thay đổi cấu trúc vectơ và gen, tiến hành cắt vectơ này bằng enzym SacI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu được ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả cắt kiểm tra plasmid của 9 dòng khuẩn lạc bằng enzym SacI
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 9 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
Hình 3.9 cho thấy: Từ đường chạy số 1 đến số 9, đều xuất hiện 2 băng ADN: băng lớn có kích thước 8,7 kb và băng nhỏ có kích thước 2,5 kb, đường chạy đ/c (đối chứng) chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất kích thước khoảng 10,8 kb. Vậy trong vectơ tái tổ hợp có chứa gen cryIA(c).
3.2.3. Kết quả biến nạp vectơ pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Sau khi đã chọn được các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α mang vectơ pB2GW7- cryIA(c), tiến hành nuôi riêng trong môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, tách plasmid và chuyển sang tế bào vi khuẩn
A. tumefaciens chủng EHA105 bằng phương pháp sung điện. Sau đó, các dòng khuẩn lạc chứa vectơ pB2GW7-cryIA(c) được chọn lọc trên môi trường YEP có bổ sung spectinomycin 50 mg/l và rifampicin 25 mg/l. Kết quả thu được ở hình 3.10.
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
Hình 3.10. Kết quả biến nạp vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào vi khuẩn
A. tumefaciens
Qua hình 3.10 cho thấy có 549 dòng khuẩn lạc có khả năng sống trên môi trường chứa đồng thời hai kháng sinh spectinomycin và rifampicin. 3.2.4 Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Để kiểm tra sự tồn tại của gen cryIA(c) trong các dòng vi khuẩn A . tumefaciens sau biến nạp. Chúng tôi tiến hành chọn và thực hiện phản ứng PCR 10 khuẩn lạc thu được với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c). Kết quả điện di sản phẩm trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 10 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1,6 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
Qua hình 3.11 cho thấy : Từ đường chạy số 1 đến đường chạy số 10 đều xuất hiện một băng ADN có kích thước 1,8 kb, tương đương kích thước gen
cryIA(c) (1,857 kb). Trong khi đó ở đường chạy đ/c (đối chứng) không có băn ADN xuất hiện. Điều đó khẳng định: tất cả các dòng khuẩn lạc phân tích đều chứa vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c) hay đã tạo thành công chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c).
3.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7-cryIA(c)
trên cây A. thaliana
3.3.1. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng