3. Nội dung nghiên cứu
1.5.Vi khuẩn B thuringiensis và gen cry
1.5.1. Những nghiên cứu chung về B. thuringiensis
Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) là một loại vi khuẩn đất được tìm thấy tại Nhật Bản vào năm 1901 [38] và ở Đức vào năm 1911 [26]. Sau đó chúng được tìm thấy ở nhiều nơi khác như đất rừng, cát bụi, phân rơi, nước biển, xác côn trùng. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí hình que, gram dương, có khả năng hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi [47]. Vi khuẩn này sản xuất ra các protein tinh khiết rất độc đối với ấu trùng của nhiều loài côn trùng nhưng không độc với động vật có xương sống (động vật có vú, chim, cá ...) [20]. Vi khuẩn này có thể sản sinh ra bốn loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố α, β, γ toxin và nội độc tố δ toxin. Trong đó nội độc tố δ toxin là quan trọng nhất. Tinh thể protein do vi khuẩn này tạo ra sau khi xâm nhập vào côn trùng sẽ bị các protease trong ruột côn trùng phân giải thành các đoạn nhỏ trong đó có đoạn mang khối lượng phân tử là 68.000 dalton chứa gần 1200 aminoaxit có hoạt tính độc gây hỏng ruột côn trùng. Năm 1984, Stahly đã tách được gen mã hóa protein này (Bt toxin) [22]. Các gen này thường định vị trên plasmid của vi khuẩn và gọi tên chung là gen ICP
(Insecticidal Crystal protein) [22]. Do vi khuẩn B. thuringiensis là vi khuẩn phức tạp có hơn 30 serotype nên chúng có chứa các gen ICP khác nhau và tạo nên những nhóm độc tố khác nhau [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
Do vi khuẩn này có khả năng diệt côn trùng tốt, nên đến từ những năm 1970 vi khuẩn này đã đươc nghiên cứu tạo ra chế phẩm để diệt sâu và được gọi là chế phẩm Bt. Chế phẩm này được dùng để diệt nhiều loại sâu hại khác nhau như bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vẩy, bộ cánh màng ... với hiệu lực khá mạnh [20]. Mặc dù được coi là thuốc trừ sâu hiệu quả cao và an toàn, nhưng nó cũng có một số hạn chế nhất định về phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn hiệu quả tác động chậm, không tiếp xúc được với côn trùng ẩn sâu dưới lá, đất. Điều đó đã phần nào làm giảm mức độ sử dụng của chế phẩm này. Những nhược điểm này hoàn toàn bị loại trừ khi người ta chuyển gen cry vào cây trồng để tạo cây trồng kháng sâu [22]. Tiếp đó, từ năm 1996 đến nay có rất nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng sâu được tạo ra như: lúa, ngô, đậu tương, bông, ... [39].
1.5.2. Những nghiên cứu về gen cry
Năm 1982, Held đã đề nghị sử dụng chữ viết tắt “cry” (Crystal) để chỉ các gen tạo tinh thể độc tố của B. thuringiensis. Dựa trên tác động chuyên biệt và sự tương đồng về trình tự, gen tạo protein độc tố có thể được chia làm sáu nhóm chính và được ký hiệu từ cryI đến cryVI. Trong mỗi nhóm lại có các nhóm phụ được ký hiệu theo chữ cái từ A đến G [20].
Gen cryI mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước từ 130 - 140 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy (Lepidoptera), điển hình như loài sâu quấn lá, sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá ...
Gen cryII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 66 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy và bộ hai cánh (Diptera), điển hình như ruồi đục quả.
Gen cryIII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 73 kDa gây độc tính lên ấu trùng bộ cánh cứng Coleoptera, gồm các loại sâu như câu cấu, xén tốc đục thân, bọ dừa ...
Gen cryIV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 72, 74, 128 và 135 kDa có tác dụng gây hại ấu trung bộ hai cánh.
Gen cryV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 80 kDa có tác dụng gây hại ấu trùng bộ cánh vẩy và bộ cánh cứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
1.5.3. Những nghiên cứu về gen cryIA
Gen cryIA(c) là gen mã hóa cho protein gây độc cho côn trùng. Trong tự nhiên gen này có nguồn gốc từ vi khuẩn B. thuringiensis [20]. Gen này đã được các nhà khoa học phân lập, mang đi giải trình tự và chỉ ra rằng chúng có kích thước là 3,534 kb. Từ sau khi trình tự gen cryIA(c) được công bố trên ngân hàng gen có nhiều công trình nghiên cứu khác được thực hiện nhằm xây dựng những hệ thống vectơ mang gen này để chuyển vào cây trồng, đánh giá khả năng biểu hiên của gen này trên cây trồng. Năm 1997, Wu và cộng sự đã chuyển thành công gen cryIA(b) vào cây lúa [60]. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ sâu chết có thể lên tới 100% khi cho sâu ăn lá cây chuyển gen [60]. Năm 2002, Bhattacharya đã chuyển thành công gen cryIA(b) lên cây bắp cải [12]. Khi tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng, Olsen chỉ ra rằng gen cryIA(c) không những giúp cây trồng có khả năng kháng sâu mà nó còn giúp cây trồng có khả năng thích nghi hơn với điều kiện nhiệt độ thay đổi [50]. Khi nghiên cứu khả năng biểu hiên gen cryIA(c) trên cây thuốc lá chuyển gen, Gulbitti đã chỉ ra rằng mức độ tích lũy protein cryIA(c) tăng lên trong giai đoạn hậu bị thương [32].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen tạo cây trồng kháng sâu cũng đã và đang được thực hiện. Năm 1997, trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen, Trần Thị Phương Liên đã tạo thành công cây thuốc lá có khả năng kháng sâu [4]. Năm 2001, trong công trình nghiên cứu của mình, Đặng Trọng Lương đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen mang gen cryIA(c) và đánh giá được khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ đó trên cây bắp cải [5].
1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana
1.6.1. Đặc điểm nông sinh học cây A. thaliana
Cây A. thaliana được tìm thấy ở vùng có khí hậu ôn đới như Châu Âu, Đông Phi, Đông nam Á, Nhật bản, Bắc Mỹ và Châu Úc. Chúng là cây thuộc họ cải có hoa thập tự, có bộ nhiễm sắc thể nhỏ (2n =10). Trong tự nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
chúng thường mọc ở những nơi đất khô cằn, hoang mạc, đất nhiều đá như bãi đất hoang, bãi đỗ xe, đường tránh tàu [28].
Mặc dù không mang lại giá trị kinh tế cho con người, nhưng với một số đặc điểm như: kích thước nhỏ, chu kỳ sinh trưởng ngắn, hệ gen nhỏ, có nhiều hạt và dễ đột biến nên cây Arabidopsis mang lại ý nghĩa lớn trong khoa học như nghiên cứu về di truyền, phân tích học thuyết về sinh học phân tử [28].
Cây A. thaliana thích hợp với cường độ chiếu sáng cao khoảng 10.000 lux, nhiệt độ môi trường từ 18 – 28oC, nhiệt độ tối thích là 22oC. Khi gặp điều kiện nhiệt độ 4o
C trong vòng 1-5 ngày hạt cây sẽ nảy mầm [28]. 1.6.2. Những nghiên cứu về cây A. thaliana
Cây A. thaliana có hệ gen nhỏ, có vòng đời ngắn, cho nhiều hạt, có nhiều dạng đột biến. Đây chính là những đặc điểm quý được nhiều nhà khoa học quan tâm và tập trung nghiên cứu.
Năm 1993, Bechtold đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào cây A. thaliana bằng phương pháp hút chân không. Kết quả chỉ ra rằng một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tỷ lệ chuyển gen là giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây. Cũng trong nghiên cứu này ông chỉ ra môi trường thích hợp cho quá trình chuyển gen vào cây A. thaliana bao gồm dung dịch MS, Vitamin, BAP và đường [10].
Năm 1994, Chang đã nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana và chỉ ra rằng giai đoạn cho tỷ lệ chuyển gen cao nhất là khi cây có nhiều nụ (chưa nở hoa) [15].
Năm 1998, Clough nghiên cứu những phương pháp chuyển gen đơn giản vào cây A. thaliana thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã đưa ra một số nhận xét: Để thu được nhiều hoa và hiệu quả chuyển gen cao, tiến hành cắt đợt hoa đầu tiên và chờ đến khi ngồng hoa dài từ 2 – 10 cm và có nhiều nụ hoa mới tiến hành chuyển gen [14]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Trong nghiên cứu này ông nhận thấy: sự điều chỉnh pH của môi trường về 5,7 không ảnh hưởng gì đến tỷ lệ chuyển gen so với đối chứng không điều chỉnh; chất kích thích sinh trưởng BAP có ảnh hưởng khá rõ đến tỷ lệ chuyển gen vào A. thaliana, khi không bổ sung BAP vào môi trường biến nạp sẽ làm giảm tỷ lệ chuyển gen đi một nửa so với đối chứng có bổ sung BAP. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP lân gấp 1000 lần (44 mM) lại gây bất lợi cho quá trình chuyển gen và làm cho tỷ lệ chuyển gen giảm đi 5- 8 lần; đường có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen, quá trình chuyển gen gần như không xảy ra hoặc xảy ra với tỷ lệ chuyển gen rất thấp nếu không có đường trong môi trường biến nạp [14].
Khi tiến hành so sánh hiệu quả chuyển gen của phương pháp sử dụng chất hoạt động bề mặt Silwet L-77 với phương pháp hút chân không, CloughS nhận thấy khi tăng nồng độ Silwet L-77 từ 0,005% lên 0,1% thì tỷ lệ chuyển gen bằng phương pháp này cao hơn phương pháp hút chân không [14].
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch khuẩn trong môi trường biến nạp đến tỷ lệ chuyển gen, tác giả chỉ ra rằng nồng độ dịch khuẩn có OD=0,8 sẽ cho tỷ lệ chuyển gen đạt cao nhất [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α và tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
chủng EHA105 do Trường Đại học Đông A - Hàn Quốc cung cấp.
- Vectơ nhân dòng pENTRTM/D-TOPO và vectơ chuyển gen pB2GW7 do hãng Invitrogen cung cấp.
- Gen cryIA(c) trong vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c) là kết quả hợp tác nghiên cứu giữa trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Đông A và Đại học Seoul - Hàn Quốc.
- Cây thử nghiệm: A. thaliana.
- Mồi sử dụng để nhân gen do hãng COSMO Genetech cung cấp gồm:
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự
cryIA(c) - F CAC CAT GGA CAA CAA CCC AAA CAT CAA
cryIA(c) - R TTA AAG ATT GTA CTC AGC CTC AAG AGT
bar - F ATC AGC TTG CAT GCC GGT CGA TCT AG
bar - R TAT CAT ACA TGA GAA TTA AGG GAG TC
Mồi xuôi của phản ứng nhân gen cryIA(c) có đặc điểm chứa trình tự CACC ở đầu 5’. Đây là trình tự rất cần thiết cho quá trình gắn sản phẩm PCR lên vectơ nhân dòng. Sau khi sản phẩm PCR tạo ra có đầu 5’ bổ sung với đầu 3’ trên vectơ tách dòng và nhờ chức năng gắn các bazơ của vùng TOPO sẽ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
làm cho sản phẩm PCR được ổn định trong vectơ nhân dòng. Mồi ngược của phản ứng nhân gen cryIA(c) và mồi nhân gen bar có trình tự bổ sung với gen cần nhân.
2.1.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài
- Môi trường LB dùng cho nuôi khuẩn E.coli gồm Bacto Trypton (Merk), Yeast Extract (Oxoid), Agar (Hạ Long)
- Môi trường YEP dùng cho nuôi khuẩn A. tumefaciens gồm Bacto Pepton (Oxoid), Yeast Extract (Oxoid), Agar (Hạ Long) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR là bộ kít PCR Master mix 2X của Fermentas
- Hóa chất sử dụng tách plasmid: bộ kít tách plasmid GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas)
- Hóa chất sử dụng tách ADN từ bản gel điện di: bộ kít GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas)
- Hóa chất dùng cho phản ứng gắn nối sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pENTR bao gồm dung dịch muôi NaCl và MgCl2 được cung cấp bởi hãng Invitrogen.
- Hóa chất dùng cho phản ứng chuyển gen cryIA(c) lên vectơ pB2GW7 bao gồm: đệm TE pH 8,0, dung dịch enzym LR clonase II và dung dịch enzym proteinase K được cung cấp bởi hãng Invitrogen
- Hóa chất sử dụng trong chạy điện di ADN: Agarose (Bio-Canada), đệm TAE (Tris base (Merk), EDTA (Merk), NaOH, Acid acetic 100% (Merk)), Loading dye (Intronbio), Ethidium bromide (Canada).
- Enzym giới hạn được sử dụng trong đề tài là enzym SacI được cung cấp bởi hãng Fermentas
- Hóa chất sử dụng cho môi trường đồng nuôi cấy bao gồm : MS (phụ lục 3), BAP (Merk), Sucrose (Việt Nam)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong đề tài - Bộ điện di DNA (Mupid 2 plus) - Bộ điện di DNA (Mupid 2 plus) - Cân phân tích Sartorius TE214S - Máy lắc SK 300
- Máy vortex IKA ZX3 - Micropipet Gilson
- Tủ lạnh 4ºC (HITACHI) tủ lạnh -20ºC (DAEWOO) và -80ºC (Sanyo) - Bể ổn nhiệt (Labtech)
- Tủ cấy vô trùng (Esco)
- Máy ly tâm MIKRO 22 (Hettich zentrifugen) - Máy ly tâm loại nhỏ (Hanil)
- Máy spindown (Hanil)
- Máy PCR EG3200 (Thermocycle)
- Máy xác định trình tự tự động AB 3130 (HITACHI) - Máy hút chân không (Wech)
- Máy chụp ảnh gel Logic 1500 (Kodak) - Lò vi sóng (LG)
- Nồi khử trùng TLG (Đức)
Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số thiết bị khác có xuất xứ từ những nước phát triển như Đức, Nhật, Hàn Quốc ... những thiết bị này có độ chính xác cao.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhân dòng gen cryIA(c) từ vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
Hình 2.1. Sơ đồ nhân dòng gen cryIA(c) bằng vectơ pENTR
2.2.1.1. Nhân gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mut-cryIA(c)
Gen cryIA(c) được nhân dòng từ vectơ pOB-Mutant#16-cryIA(c) bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cryIA(c) -F và cryIA(c) – R [48]. Phản ứng tiến hành với thể tích 50 μl, đựng trong ống eppendorf 0,2 ml bao gồm các thành phần:
+
Gắn nối PCR với mồi đặc hiệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 Nước khử ion 10X buffer 10X dNTP cryIA(c) - F cryIA(c) - R ADN khuôn (50 ng/µl) Taq polymerase 32,5 µl 5 µl 5 µl 2 µl 2 µl 3 µl 0,5 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng được đặt như sau
95oC trong 5 phút 95 oC 45 trong giây
55 oC 45 trong giây 30 chu kỳ 72 oC trong 60 giây
72 oC trong 7 phút
2.2.1.2. Gắn gen cryIA(c) lên vectơ tách dòng pENTR™/D-TOPO®.
Sản phẩm PCR ở thí nghiệm trên được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pENTR TM/D - TOPO, thành phần phản ứng gắn nối gồm: 1 µl dung dịch đệm TOPO 6X, 4 µl sản phẩm phản ứng PCR, 1 µl vectơ tách dòng pENTRTM/D - TOPO. Phản ứng gắn nối thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α khả biến theo phương pháp sốc nhiệt ở 42o
C [30].
2.2.1.3. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc thu được sau nhân dòng với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Khuẩn lạc E. coli chứa vectơ tái tổ hợp pENTR-cryIA(c) được chọn lọc trên môi trường LB chứa kanamycin 100 mg/lít. Kiểm tra hiện diện của của gen cryIA(c) trong các chủng khuẩn bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cryIA(c)-F và cryIA(c)-R. Thành phần phản ứng và chu kỳ phản ứng tương tự như phần 2.2.1.1
2.2.1.4. Xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng
Sau khi đã chọn được các dòng khuẩn lạc mang gen cryIA(c) bằng phương pháp PCR, nuôi riêng các dòng khuẩn lạc đó trên môi trường lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l, tách plasmid và xác định trình tự gen cryIA(c)
bằng phương pháp dideoxy của Sanger [53] trên máy giải trình tự tự động (autosequencer). Kết quả giải trình tự được phân tích trên phần mềm PC/gene.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Sau khi đã có trình tự gen cryIA(c) tiến hành so sánh trình tự đó với trình tự gen được cung cấp và so sánh với ngân hàng gen để phân tích sự tương đồng.
2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c)