- Là nghiên cứu mô tả cắt ngang tiến cứu
2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.3.1. Nghiên cứu về lâm sàng
Các bệnh nhân đều được học viên khám bệnh tỷ mỷ, khai thác tiền sử bệnh, các thông số đều được ghi vào mẫu bệnh án nghiên cứu với các nội dung sau [16, 40, 90]:
- Lý do vào viện
- Cách khởi phát bệnh: cấp tính, bán cấp, lặng lẽ. - Thời gian phát hiện bệnh: < 2 tuần, > 2 tuần. - Các triệu chứng lâm sàng:
+/ Triệu chứng toàn thân: Sốt, mệt mỏi, chán ăn, gầy sút, ra mồ hôi trộm. +/ Triệu chứng cơ năng: Ho, ho khan, ho có đờm, ho máu, tức ngực, khó thở.
+/ Triệu chứng thực thể: Ral ẩm, ral nổ, ral rít, ngáy, hội chứng 3 giảm, rì rào phế nang giảm.
2.3.2.. Nghiên cứu về Xquang phổi chuẩn:
Tất cả các bệnh nhân đều được chụp Xquang phổi chuẩn thẳng, nghiên, phân loại tổn thương, mức độ tổn thương cơ bản [3,15,24,25].
- Tổn thương cơ bản: Nốt, hang, thâm nhiễm, vôi xơ. - Mức độ tổn thương: Nhẹ, trung bình, nặng.
- Tổn thương lan tràn: Là tổn thương xuất hiện sau tổn thương ban đầu có dạng nốt, thâm nhiễm, có thể phá hủy ( có 3 dạng lan tràn: Lan tràn đỉnh nền, lan tràn chéo, lan tràn sau trước).
- Phân loại hang:
+/ Hang nhỏ: Đường kính < 2 cm.
+/ Hang trung bình: Đường kính từ 2 đến 4 cm. +/ Hang lớn: Đường kính từ 6 cm trở lên.
+/ Hang phồng: Là hang có phế quản dẫn lưu, khi to ra ( do không khí không thoát được), khi nhỏ lại ( sau khi không khí thoát ra ngoài), có riềm mỏng.
+/ Hang thành dày: Khi độ dày của thành hang>3mm. +/ Hang thành mỏng: Khi độ dày hang < 3mm.
2.3.3. Nghiên cứu về xét nghiệm máu ngoại vi:
Xét nghiệm hồng cầu, bạch cầu, huyết sắc tố tại khoa huyết học bệnh viện 198, phân loại thiếu máu, tăng giảm bạch cầu theo Nguyễn Thế Khánh và cs 1999/5, Beer MH và cs 1999/44.
- Số lượng bạch cầu bình thường: 5000 – 8000/mm³. - Giảm bạch cầu: < 5000/ mm³.
- Tăng bạch cầu: >8000/ mm³.
- Thiếu máu nặng: Hồng cầu <2 triệu - Thiếu máu vừa: Hồng cầu 2-3 triệu
- Thiếu máu nhẹ: Hồng cầu từ 3,1 đến dưới 4 triệu. Công thức bạch cầu:
- Bạch cầu đa nhân trung tính: Bình thường 60-70%, giảm <60%, tăng >70%.
2.3.4. Nghiên cứu về soi phế quản ống mềm:
2.3.4.1.Dụng cụ:
Ống soi phế quản ký hiệu BFP 180 của hãng Olympus( Nhật Bản) - Trường nhìn 100◦
- Độ uốn lên 180◦ - Độ uốn xuống 100◦
- Đường kính ngoài : 4,9mm - Đường kính trong: 2,2mm - Chiều dài toàn bộ:760mm - Chiều dài hoạt động: 550mm
- Nguồn sáng Xenon, các dụng cụ hỗ trợ lấy bệnh phẩm
2.3.4.2.Chỉ định và chống chỉ định:
- Chỉ định: Bệnh nhân có tổn thương dạng: nốt, thâm nhiễm, hang, vôi hóa trên Xquang, xét nghiệm đờm 3 lần âm tính.
- Chống chỉ định: Loạn nhịp tim, suy tim, nhồi máu cơ tim, rối loạn đông máu, chảy máu, đang hen phế quản, khái huyết nặng, bệnh nhân không hợp tác.
2.3.4.3. Quy trình soi phế quản:
- Bệnh nhân được giải thích rõ lợi ích của soi phế quản để hợp tác, nhịn ăn ít nhất 6 giờ trước khi soi.
- Tiền mê bằng Seduxen, Atropin, gây tê tại chỗ bằng Lidocain 2%. - Hình ảnh nội soi được in bằng máy in Sony.
Xác định độ hẹp phế quản theo 3 mức độ: +/ Hẹp độ 1: Khẩu kính phế quản hẹp lại 1/3. +/ Hẹp độ 2: Khi khẩu kính phế quản hẹp lại 2/3. +/ Hẹp độ 3: Khi khẩu kính phế quản hẹp lại trên 2/3.
Sau khi được tiền mê, ống soi được đưa vào qua đường mũi hoặc miệng, gây tê từng lớp bằng Lidocain 2%, sau khi quan sát tổn thương sẽ tiến hành lấy bệnh phẩm xét nghiệm.
2.3.4.4. Các kỹ thuật lấy bệnh phẩm:
* Rửa phế quản phế nang:
Sau khi xác định lỗ phế quản có tổn thương trên Xquang và quan sát trong khi soi, đưa đầu ống soi sát lỗ phế quản tổn thương, bơm từ từ 60 ml dung dịch NaCL 0,9%, hút dịch cho vào ống lấy bệnh phẩm vô trùng để gửi xét nghiệm AFB, nấm, vi khuẩn, PCR lao, Bactec lao.
2.3.5. Kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp bằng kính hiển vi:
Có các kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen, nhuộm Kin-youn, nhuộm soi huỳnh quang,các kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được vi khuẩn kháng cồn, kháng toan AFB, không thể định danh được vi khuẩn và cũng chỉ phát hiện được AFB với điều kiện số lượng AFB trong 1ml bệnh phẩm từ 5000-10000 vi khuẩn.
2.3.6. Kỹ thuật PCR ( Được thực hiện tại Labo vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương do Tiến sỹ Nguyễn Văn Hưng – Trưởng khoa chỉ đạo). Trung ương do Tiến sỹ Nguyễn Văn Hưng – Trưởng khoa chỉ đạo).
2.3.6.1. Nguyên lý:
PCR là kỹ thuật nhân một trình tự AND đích đặc hiệu cho M. Tuberculosis trong một chuỗi các chu kỳ tổng hợp AND gồm 3 giai đoạn:
- Biến tính ( 94◦C). - Lai ghép ( 65◦C). - Tổng hợp ( 72◦C).
Lặp lại với sự trợ giúp của men AND Polymerase chịu nhiệt, các đoạn mồi Oligonucleotid đặc hiệu với các Deoxynucleotid Triphosphat (DNTP). AND Polymerase là men có nhiệm vụ sao chép AND trong quá trình sinh sản tế bào, nó cũng có thể tái sao chép nhiều lần mảnh AND nếu được kích thích đặc hiệu. Bằng cách sử dụng một AND Polymerase đặc hiệu như Taq polymerase và các chất cơ sở cần thiết cho tổng hợp AND, người ta có thể nhân lên tới triệu lần một mảnh AND mà ta muốn phát hiện như gen GroE đối với trực khuẩn lao, sau khi chuỗi đích được khuyếch đại, vào lúc này có thể phát hiện bằng lai tạo với mẫu dò gien [19].
2.3.6.2. Thực hiện kỹ thuật[36,57]
* Chuẩn bị mẫu: 5ml dịch rửa phế quản phế nang vô trùng.
* Sử lý mẫu: Dùng Guadinium thionyanate (GuSCN) để ly giải tế bào và bất hoạt men Nuclease, bộc lộ AND và tách lọc chúng bằng gắn lên các hạt Silica hoặc diatom.
* Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Pha dung dịch hỗn hợp phản ứng gồm: 4 loại nucleotid (2µM), 2 đoạn AND mồi (0,2 µM/mỗi đoạn), men AND Polymerase (1U/50µL), trong dung dịch đệm Tris HCL (10mM Tris HCL và 50 mM NaCL) có chứa MgCL2 (2 µM), Uracil AND Glycosylate (UNG) được cho thêm vào hỗn dịch để chống nhiễm.
Trình tự 2 đoạn mồi: INS2: 5’-GCGTAGGCGTTCGGTGACAAA-3’. Pt8:5’-GTGCGGATGGTCGCAGAGAT- 3’.
* Phản ứng PCR được thực hiện trong 40 chu trình, mỗi chu trình gồm 3 giai đoạn phản ứng:
- Giai đoạn biến tính: 94◦C×1,5’ - Giai đoạn lai ghép: 65◦C×2’
- Giai đoạn tổng hợp: 72◦C×3’
Và chạy điện di để phát hiện sản phẩm PCR trên gien Agarose 2% trong đệm TBE (Tri 0,89 M, axit Boric 0,89M, EDTA 0,02M) với cường độ dòng điện 2-3 V/cm², chụp ảnh bằng tia huỳnh quang.
* Đánh giá kết quả: Do PCR có độ nhậy cao (Phát hiện 10fg tương đương 1-3 vi khuẩn) nên kết quả phải phân tích, đánh giá so với chứng âm( chỉ có dung dịch hỗn hợp phản ứng) và chứng dương ( AND của M. Tuberculosis ), mỗi bệnh phẩm đầu được kiểm tra yếu tố ức chế bằng cách chạy PCR với 2 ống: ống a chứa 10 bệnh phẩm đã sử lý, ống b chứa 5 bệnh phẩm đã xử lý + 5 AND của M.Smegmatis. Kết quả là dương tính nếu 2 ống a và b đều dương tính, kết quả âm tính nếu ống a âm tính, ống b dương tính, bệnh phẩm có chất ức chế nếu cả hai ống a và b đều âm tính( không có vạch đặc hiệu).
2.3.7. Kỹ thuật nuôi cấy Bactec 460:
2.3.7.1.Nguyên lý:
Là phương pháp nuôi cấy Mycobacterium trong môi trường lỏng có gắn phóng xạ 14C, khi Mycobacterium phát triển đồng vị phóng xạ 14C được đánh dấu sẽ chuyển hóa cùng với sự phát triển Mycobacterium và sinh ra CO2 và máy Bactec 460 TB sẽ đo được lượng CO2 này và đánh giá kết quả theo chỉ số tăng trưởng.
2.3.7.2. Kỹ thuật:
Lọ nuôi cấy là lọ 12 B Bactec đã được chuẩn bị theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất và được cho vào 0,5ml dung dịch nuôi cấy. Lọ nuôi cấy này được theo dõi với máy Bactec 460TB trong vòng 2-3 tuần và 1 lần 1 tuần trong 6 tuần. Khi lọ nuôi cấy được xác định có chỉ số tăng trưởng (GI) > 10 đơn vị được soi là có khả năng dương tính sẽ được theo dõi hàng ngày cho đến khi
GI > 50 khi quan sát được coi Bactec dương tính và thời gian dương tính dựa vào ngày đầu tiên mà GI > 50.
2.3.8. Kỹ thuật nuôi cấy BACTEC – MGIT 960:
2.3.8.1. Nguyên lý:
Là kỹ thuật nuôi cấy sử dụng môi trường lỏng MGIT ( Mycobacterium growth indicator tube ). Trong môi trường nuôi cấy khi vi khuẩn thực hiện quá trình trao đổi chất và nhân lên sẽ tiêu thụ oxy hòa tan trong môi trường và làm nồng độ oxy hòa tan trong môi trường giảm đi. Sự giảm nồng độ oxy này sẽ giải phóng ra môi trường chất chỉ thị huỳnh quang ( được gắn ở đáy ống bằng hợp chất silicon chịu nhiệt) khỏi ức chế. Chất này sẽ phát quang màu vàng nhạt dưới ánh sáng tử ngoại có thể thấy bằng mắt thường. Môi trường nuôi cấy thường sử dụng là Middlebrook 7H9. Ngoài ra còn sử dụng OADC là hỗn hợp chất kích thích sự phát triển của vi khuẩn.
2.3.8.2. Kỹ thuật:
- Bệnh phẩm được lấy như bệnh phẩm để soi kính hiển vi bình thường, sau đó bệnh phẩm được loại bỏ tạp nhiễm bằng dung dịch Natrihydroxyl 4%
- Sau đó bệnh phẩm này được đưa vào lọ 50ml và ly tâm trong vòng 15 phút và bỏ phần nổi ở trên ống ly tâm.
- Sau khi đã loại bỏ phần nổi cao ở ống đã ly tâm, đưa dung dịch còn lại vào lọ 50ml có chứa PBS pH 6,4 và tiếp tục ly tâm loại bỏ phần nổi cao.
- Tiếp tục thêm 0,5ml PHS pH6,8 vào lọ bệnh phẩm đã ly tâm ở trên Bactec – MGIT 960 và quan sát các mẫu dương tính, nếu không chờ tối đa 8 tuần sau.
- Những mẫu có khả năng dương tính thường cho kết quả sau 8- 14 ngày, khi đó sẽ xác định loại AFB và thử độ nhậy của loại AFB này.
- Ống nuôi cấy MGIT có chứa 7ml Middlebrook 7H9 và 0,8 ml PANTA.
2.4.Xử lý số liệu:
Số liệu thu được sử lý trên máy vi tính, sử dụng các thuật toán X², T Student Tính toán các giá trị triệu chứng trong nhóm nghiên cứu: Độ nhậy (Se), độ đặc hiệu (Sp), trị số dự đoán dương (PPV), trị số dự đoán âm (NPV), độ chính xác( AC) theo Tamura M 1989/187 ( dương tính thật bệnh nhân lao có triệu chứng, nuôi cấy dương tính, âm tính giả bệnh nhân lao không có triệu chứng, nuôi cấy dương tính, âm tính thật là bệnh không phải lao, nuôi cấy âm tính, dương tính giả là bệnh nhân không lao, nuôi cấy âm tính)[7].
Se = Dương tính thật %
Âm tính giả + Dương tính thật
Sp = Âm tính thật % Âm tính thật + Dương tính giả PPV = Dương tính thật % Dương tính thật + Dương tính giả NPV = Âm tính thật %
Âm tính thật + Âm tính giả
AC = Dương tính thật + Âm tính
thật %
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Nhóm chứng (30 bệnh nhân)
Lâm sàng, Cận
lâm sàng Soi rửa phế quản Nhóm nghiên cứu ( 60 bệnh nhân) PCR-lao dịch rửa phế quản Tính Se, PPV, NPV, AC Tính Sp, PPV, NPV Kết luận Lâm sàng, Cận lâm sàng, PCR-
lao(dịch phế quản), Bactec- MGIT 960 dương tính
Chương 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu:
Bảng 3.1. Tuổi và giới của nhóm nghiên cứu
Giới Tuổi Nam Nữ Tổng số (%) 18-24 25-34 35-44 45-54 55-65 >65
Bảng 3.2. Tuổi và giới của nhóm lao phổi có PCR dương tính, PCR âm tính
Kết quả Dương tính Tỷ lệ % Âm tính Tỷ lệ %
Nam Nữ Nam Nữ 18-24 25-34 35-44 45-54 55-65
3.2. Đặc điểm lâm sàng của nhóm lao phổi AFB (-) nuôi cấy Bactec dương tính.
Bảng 3.3.Thời gian mắc bệnh
PCR Dương tính Âm tính P
> 2tuần < 2tuần
Bảng 3.4 Khởi phát bệnh
Kết quả
Khởi phát Dương tính Âm tính Se Sp
Cấp tính Bán cấp Lặng lẽ
Bảng 3.5. Tiền sử bệnh tật và các yếu tố nguy cơ
PCR Dương tính Âm tính
n % n %
Nghiện thuốc lá, lào Đái tháo đường Bệnh Goutte Cắt đoạn dạ dày
Uống corticoid kéo dài Gia đình bị lao
Bảng 3.6. Các bệnh phối hợp với bệnh khác
PCR Dương tính Âm tính
n % n %
Đái tháo đường Viêm gan mạn Bệnh Goutte Lao hạch Lao màng bụng Lao màng phổi Lao cột sống
Bảng 3.7. Triệu chứng toàn thân
Kết quả Triệu chứng PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC Sốt nhẹ về chiều Sốt cao Mệt mỏi Chán ăn Gày sút cân Ra mồ hôi trộm
Bảng 3.8.Triệu chứng cơ năng và thực thể Kết quả Triệu chứng PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC Ho khan Ho có đờm Ho có máu Đau ngực Khó thở Ral nổ,ẩm Ral rit, ngáy HC 3 giảm RRFN giảm
3.3.Đặc điểm Xquang chuẩn và xét nghiệm máu thường qui.
Bảng 3.9.Tổn thương cơ bản trên Xquang phổi chuẩn
Kết quả Triệu chứng PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC Thâm nhiễm Nốt Hang Xơ vôi Đông đặc
Bảng 3.10. Vị trí tổn thương Kết quả Triệu chứng PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC Thùy trên Thùy giữa Thùy dưới Phổi phải Phổi trái Hai bên Bảng 3.11. Tổn thương phối hợp PCR Dương tính Âm tính n % n % Tổn thương riêng rẽ Tổn thương nốt
Tổn thương thâm nhiễm Tổn thương phối hợp Thâm nhiễm+Nốt+Hang
Thâm nhiễm + Nốt + Hang + Xơ Nốt+Hang Nốt+Xơ Thâm nhiễm+Nốt Nốt + Vôi Nốt + Vôi xơ Xơ+Hang
Bảng 3.12.Giá trị tổn thương phối hợp
Kết quả Tổn thương
PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC
Riêng rẽ Phối hợp
Bảng 3.13. Tổn thương lan tràn trên Xquang chuẩn
Kết quả Đỉnh Hạ đòn Thùy dưới
n % n % n %
Thâm nhiễm Nốt
Phá hủy
3.14.Mức độ tổn thương trên Xquang
PCR
Mức độ PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC
Nhẹ Vừa Nặng
Bảng 3.15.Tổn thương phối hợp trên Xquang phổi chuẩn
PCR Tổn thương PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC Tràn dịch MP Dầy dính MP Co kéo rốn phổi Viêm rãnh LT Giãn phế nang
Bảng 3.16. Xét nghiệm hồng cầu máu ngoại vi
PCR PCR (+) PCR (-) P
n % n %
> 4 triệu 3-4 triệu
<3 triệu
Bảng 3.17. Xét nghiệm bạch cầu máu ngoại vi
PCR Bạch cầu PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC 5000-<7000 7000-10000 1000-<15000 >15000 3.4. Hình ảnh nội soi
Bảng 3.18. Giá trị của các triệu chứng nội soi
PCR
Hình ảnh nội soi PCR(+) PCR(-) Se Sp PPV NPV AC
Viêm mưng mủ Hẹp phế quản Vặn xoắn phế quản Xung huyết niêm mạc Sần sùi niêm mạc U sùi pq
Bình thường
Bảng 3.19. Kết quản PCR tương ứng với hình ảnh nội soi
Kết quả Viêm mưng Hẹp phế Vặn xoắn Xung huyết Sần sùi niêm U sùi phế Bình thường
PCR mủ quản phế quản niêm mạc mạc quản Dương tính Âm tính
3.5. Hiệu quả chuẩn đoán của xét nghiệm PCR dịch phế quả
Bảng 3.20. Kết quả xét nghiệm PCR so với xét nghiệm Bactec
PCR
Kết quả Dương tính thật Âm tính thật Dương tính giả Âm tính giả n
%
Bảng 3.21. Giá trị xét nghiệm PCR dịch phế quản
Kết quả
PCR Se Sp PPV NPV AC
PCR (+) PCR(-)
Chương 4
DỰ KIẾN BÀN LUẬN
4.1.Bàn về đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
4.2. Bàn về đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân lao phổi AFB âm tính có PCR (-), PCR(+) và Bactec dương tính âm tính có PCR (-), PCR(+) và Bactec dương tính
4.3. Bàn về giá trị chẩn đoán lao phổi của xét nghiệm PCR dịch phế quản4.4.Bàn về hình ảnh nội soi phế quản ở bệnh nhân lao phổi có nuôi cấy 4.4.Bàn về hình ảnh nội soi phế quản ở bệnh nhân lao phổi có nuôi cấy Bactec - MGIT dương tính, PCR (-), PCR(+) trong dịch phế quản
4.5.Bàn về giá trị tổ hợp các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng chẩn đoán lao phổi AFB âm tính(nuôi cấy Bactec - MGIT dương tính).
DỰ KIẾN KẾT LUẬN
5.1. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của lao phổi AFB âm tính
5.2.Giá trị của xét nghiệm PCR dịch phế quản trong chẩn đoán lao phổi AFB âm tính.
1. Vũ Văn Biên (1995) Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và bước đầu tìm hiểu một số yếu tố nguy cơ lao phổi mới phát hiện ở người lớn. Luận văn thạc sỹ y học, Học viện quân y