Cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb) có nhiều tác dụng trong việc điều trị bệnh. Nhân dân thường thu hoạch quanh năm, nhưng vẫn tốt nhất là vào mùa thu đông. Phần củ được rửa sạch, thái mỏng rồi phơi khô để dùng dần [3].
Theo kinh nghiệm dân gian, nhân dân hay dùng để chữa đau xương, lợi gân cốt, làm thuốc bổ dạ dày, làm cho ra mồ hôi, giải độc cơ thể, chữa ghẻ lở [4], ngoài ra còn chữa viêm thận, viêm bàng quang, chữa bệnh tràng nhạc, mụn nhọt độc, viêm mủ ở da, chữa bệnh giang mai, giải độc thủy ngân và bạc [3].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM
Cây thổ phục linh còn có tên là cây khúc khắc,vũ dư lương,thổ tỳ giải, sơn kỳ lương, có tên khoa học là Smilax glabra Roxb, thuộc họ Kim cang -
Smilacacea, thường mọc hoang ở rừng núi. Củ được thu làm thuốc. Theo Đông y, thổ phục linh vị ngọt, nhạt, tình bính, có tác dụng tiêu độc, trừ phong thấp, mạnh gân xương, tán uất kết, thanh nhiệt, lợi thấp… Nó thường dùng để chữa tê thấp, đau mỏi, lở ngứa, tiêu hóa kém, viêm thận, viêm bàng quang, giang mai, viêm da mủ, giải độc thủy ngân và bạc, eczema (chàm) và một số bệnh ung thư.
Nhiệm vụ của luận văn là phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được trong củ của cây thổ phục linh bằng các phương pháp vật lý, hoá học hiện đại.
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là củ cây thổ phục linh. Mẫu tươi được thu hái vào tháng 2/2010 tại Đồng Hỷ, Thái Nguyên được rửa sạch.
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là Smilax glabra Roxb họ Kim cang - Smilacaceae. Ngoài ra còn có tên là khúc khắc, vũ dư lương, thổ tỳ giải, sơn kỳ lương.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ảnh 1: Cây thổ phục linh Ảnh 2: Củ cây Thổ phục linh
Bộ phận mẫu được thái nhỏ sau đó hong khô ở nơi thoáng mát hoặc sấy ở nhiệt độ 500
C - 60 0C tới khi khô giòn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bính ngâm chiết với metanol hoặc etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu.
Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cặn chiết thu được đem chiết lần lượt bằng dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, etyl axetat, metanol).
Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những phương pháp khác nhau: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột lặp lại nhiều lần v.v...để được chất tinh khiết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết
Để phân tìch và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột thường
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất
Các chất phân lập được ở dạn g tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hính, Rf, điểm nóng chảy, đo hoạt tình quang học v.v.. khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ hồng ngoại (FT- IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), HSQC, HMBC, DEPT với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D- NMR) tuỳ theo chất cụ thể.
2.2. Dụng cụ hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ, hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tìch (PA).
Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kìch thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ 120C thời gian từ 1,5 giờ đến 2 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).
Các hệ dung môi triển khai SKLM:
1. n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ A
2. Cloroform - metanol (7 : 1) hệ C 3. Cloroform - metanol (5 : 1) hệ D 4. Cloroform - metanol (3 : 1) hệ E (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100oC để phát hiện các hợp chất.
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C) x 100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 đến 0,200 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kình hiển vi Boëtus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dưới dạng viên nén KBr.
- Phổ 1H, 13C-NMR, HSQC, HMBC ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, dung môi CDCl3, DMSO.
Phổ khối ghi trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC- MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD.
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây
2.3.1. Thu nhận các dịch chiết
Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm. Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n- hexan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, làm khan bằng Na2SO4. Việc thu nhận các dịch chiết từ cây thổ phục linh (Smilax grabra Roxb) tóm tắt trong sơ đồ 2.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu cây thổ phục linh (Smilax glabra)
Sm. H Sm. E Sm. M
Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4 , lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Như vậy từ củ cây Smilax glabra sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là:
Sm. H, Sm. E, Sm. M
Ký hiệu:
Sm. H: Cặn chiết n-Hexan của củ cây Smilax glabra
Sm. E: Cặn chiết EtOAc của củ cây Smilax glabra
Sm. M: Cặn chiết MeOH của củ cây Smilax glabra
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ củ cây thổ phục linh ở Thái Nguyên được nêu trong bảng 2.1
Mẫu khô (2kg) nghiền nhỏ n- hexan ( 8.3g ) Etylaxetat ( 37.3g ) Metanol (31,1g) Cặn tổng Metanol 1. MeOH
2. Cất loại dung môi dưói áp suất giảm 3. Cặn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ củ cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.,)
Mẫu thu vào tháng 02/2010
Khối lượng mẫu khô (g)
Khối lượng cặn chiết thu được (g)
n-hexan EtOAc MeOH
Củ 2000g 8,3 ( Sm.H) 37,3 ( Sm.E) 31,1 (Sm.M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tình các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydric acetic + 1ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch cloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tình.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tình.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloid
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tình.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tình.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tình.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ìt bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bính cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tình với các flavonoid.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tình được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tình, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tình.
Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tình cho cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glucosid tim
Chuẩn bị dịch thử định tình cũng làm như mục 2.3.2.1.
+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tình với vòng butenolid.
+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tình với các glucosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phút là phản ứng dương tình.
Kết quả phân tìch định tình các nhóm chất trong cây Smilax glabra
được nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 :Kết quả định tính các nhóm chất trong củ cây thổ phục linh
TT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Củ
1 Sterol Lieberman-Bourchard Màu xanh vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam -
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + FeCl3 5% Xanh thẫm +
4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bông Có kết tủa - 5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH + H2SO4đ Nâu đỏ rõ + 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong HCl +
Chú giải : + : Phản ứng dương tình ─ :Phản ứng âm tình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. Phân lập và tinh chất các chất
2.3.1. Cặn dịch chiết n-hexan của củ (Sm. H)
Lấy 8,3 g cặn chiết hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi etylaxetat-hexan theo tỷ lệ tăng dần từ 0-100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5-10 ml/ phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5%, sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi.
2.4.1.1. - Sitosterol (Sm.H1)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan - etyl axetat (20:1), thu được khối chất rắn vô định hính, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu được những tinh thể hính kim, không màu, có khối lượng 23mg, RfA=50, nóng chảy ở 135-136C.
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet 0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 và Me- 27);0,83 (3H, t, 7.32Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, d, J 5Hz, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3); (ppm): 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 71,8 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,1 (d, C-17); 50,2 (d, C-9); 45,9 (d, C-24); 42,3 (s, C-13); 42,3 (t, C-4); 39,8 (t, C-12); 37,3 (t, C-1); 36,5 (s, C-10); 36,2 (d, C- 20); 33,9 (d, C-8); 31,9 (t, C-7); 31,7 (t, C-2); 29,2 (d, C-25); 28,3 (t, C-16); 26,2 (t, C-23); 24,3 (t, C-15); 21,1 (t, C-11); 19,8 (q, C-26); 19,4 (q, C-19); 19,1 (q, C-27); 18,8 (q, C-21); 11,9 (q, C-29); 11,9 (q, C-18); 23.1 (t, C-28); 42.3 (t, C-4). 2.4.1.2. - Sitosterol-glucopyranosit Sm.H2
Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi etylaxetat thu được khối chất rắn vô định hính, có khối lượng 25,1mg, RfB=62, nóng chảy ở 269-270o
C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1073, 1026. Phổ EI-MS : m/z (%) : 396 [M - C6H12O6]+ . Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) : 0.70 (3H, s, 18-Me), 0.93 (3H, s, 19-Me), 0.94 (3H, s, Me). Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) : 140.8 (s, C-5), 122.3 (d, C-6), 101.5 (d, C-1’), 79.5 (d, C-3), 76.9 (d, C-5’), 76.2 (d, C-3’), 74.0 (d, C-2’), 70.8 (d, C-4’), 62.3 (t, C-6’), 57.2 (d, C-14), 56.5 (d, C-17), 50.7 (d, C- 9), 46.4 (d, C-24), 42.7 (s, C-13), 40.2 (t, C-12), 39.1 (t, C-4), 37.6 (t, C-1), 37.1 (s, C-10), 36.4 (d, C-20), 34.4 (t, C-22), 32.3 (d, C-8), 32.2 (t, C-7), 29.9 (t, C-16), 29.7 (t, C-25), 28.5 (t, C-2), 26.7 (t, C-23), 24.6 (t, C-15), 23.5 (t, C- 28), 21.4 (t, C-11), 19.9 (q, C-19), 19.5 (q, C-21), 19.2 (q, C-26), 19.0 (q, C- 27), 12.1 (q, C-29), 12.0 (q, C-18).
2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat của củ (Sm. E)
Dịch chiết etylaxetat làm khan bằng Na2SO4, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 36,5g bột thô và 12 g cặn chiết. Kiểm tra sắc ký lớp mỏng thấy các chất chủ yếu tập trung ở bột thô. Làm tương tự như mục 2.4.1 từ 20g bột thô EtOAc đem tách trên cột silicagel. Rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform-metanol tăng dần theo độ phân cực (0-100%), dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi.
2.4.2.1. - Sitosterol-glucopyranosit Sm.E
Rửa giải cột bằng hệ dung môi clorform - metanol theo tỷ lệ 95:5 thu được thu được khối chất rắn vô định hính, có khối lượng 10,7mg, RfB=62, nóng chảy ở 269-270o
C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
rhamnopyranoside (Smitilbin)
Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột cloroform - metanol theo tỷ lệ 90:10 thu được khối chất rắn vô định hính. Kết tinh lại trong metanol thu được chất rắn màu trắng khối lượng 37,2mg, RfC=60 nóng chảy ở 165o
C. Phổ FT-IR max (cm-1): 3493, 3443, 3314, 2950, 1619, 1581, 1465, 1366, 1153, 1042, 975. Phổ ESI-MS (m/z : %): Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) : 11,74 (1H, s, 5-OH), 8,85 (2H, brs, 3’,5’-OH ), 6,84 (1H, d, J 1,2Hz, H-2’), 6,74 (1H, s, H-4’), 6,72 (1H, s, H-6’), 5,94 (1H, d, J 2,0Hz, H-8), 5,92 (1H, d, J 2,0Hz, H-6), 5,54 (1H, d, J 2,5Hz, H-2), 4,76 (2H, brs, H-1’’ ), 4,21 (1H, d, J 2,5Hz, H-3), 3,47 (1H, brs, H-2’’), 3,19 (1H, dt, J 8,9 và 10,9Hz, H-3’’), 3,05 (1H, t, J 6,1 và 9,1Hz, H-4’’), 2,46 (1H, dd, J 6,4 và 9,4Hz, H-5’’), 0,84 (3H, d, J 6,2Hz, H-6’’). Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) : 193,02 (s, C-4), 167,04 (s, C-7), 163,94 (s, C-5), 162,44 (s, C-9), 145,10 (s, C-3’), 144,93 (s, C-5’), 126,34 (s, C-1’), 117,57 (d, C-4’), 115,07 (d, C-6’), 114,06 (d, C-2’), 100,26 (s, C-10), 98,82 (d, C-1’’), 96,15 (d, C-6), 95,15 (d, C-8), 79,92 (d, C-2), 73,32 (d, C-3), 71,21 (d, C-4’’), 70, 22 (d, C-3’’), 70, 22 (d, C-2’’),68,96 (d, C- 5’’), 17,56 (q, C-6’’). 2.4.2.3 Chất E24.1.11: 5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavanonone-3-O-L- rhamnopyranoside (astilbin)
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform -metanol theo tỷ lệ 90:10 thu được khối chất rắn vô định hính. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cloroform - metanol tỷ lệ 9:1 thu được hỗn hợp hai chất có RfD = 55 và RfD = 32. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cột cloroform - metanol theo tỷ lệ 7:1 thu được 26mg chất kết tinh hính kim, màu trắng, RfD = 55 và 29,1mg chất kết tinh hính kim, màu