5. Tính mới của đề tài
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo chịu mặn
Ly trích DNA từ cây lúa:
Phương pháp ly trích DNA thực hiện theo quy trình của IRRI (2011) [49] và Nguyễn Thị Lang (2002) [9].
Mẫu lá lúa tươi, còn non (2-3 cm) thu được nghiền bằng cối và chày. Sau đó, 400μl dung dịch ly trích DNA (DNA extraction buffer) được cho vào mẫu lá nghiền. Các mẫu mô lá được nghiền đến khi dung dịch mẫu chuyển sang có màu xanh lá cây (tế bào bị phá vỡ và phóng thích ra diệp lục). Dung dịch mẫu tiếp tục được thêm vào 400μl ADN extraction buffer, trộn và lắc đều. Sau đó, 400μl dung dịch mẫu này được hút và chuyển sang một tube 1,5 ml đã được ghi nhãn tên giống. 800μl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) vào tube mẫu, trộn và lắc đều, sau đó ly tâm với 12.000 vịng trong 3 phút. Các tube mẫu sau ly tâm sẽ phân thành hai lớp riêng biệt, phần dung dịch phía trên (supernatant) được lấy và chuyển sang một tube khác có cùng thể tích. Mẫu được thêm vào 800 μl ethanol (100% trữ lạnh), trộn kỹ bằng máy lắc và tiếp tục ly tâm với tốc độ 13.000 vòng trong 5 phút. Dung dịch mẫu lúc này xuất hiện phần kết tủa (pellet) bên dưới tube. Thu phần kết tủa và rửa bằng ethanol (70%). Phần kết tủa là phần DNA tổng số được phơi khô ở nhiệt
độ phần (~25-30oC). Hòa tan DNA vào 50μl TE buffer (Bảng 2.1) và trữ ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng.
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA và TE buffer (pH = 8)
Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA (5 ml)
Thành phần Nồng độ Thể tích Chức năng
Tris (pH = 8) 50 mM 0,25 ml Ổn định pH = 8
EDTA (pH = 8) 25 mM 0,25 ml Kết hợp với Mg2+, cofactor của DNase (tự do)
NaCl 300 mM 0,30 ml Kết hợp với ethanol 100% để
tủa và rửa sạch DNA, bảo vệ DNA
SDS 1% 0,50 ml Biến tính protein
Nước cất 3,70 ml Dung mơi hịa tan
Thành phần dung dịch TE buffer (pH = 8) (50 ml)
Thành phần Nồng độ Thể tích
Tris (pH = 8) 10 mM 0,5 ml EDTA (pH = 8) 0,5 mM 0,1 ml
Nước 49,4 ml
(Nguồn: Nguyễn Thị Lang, 2002) [9]
Khuếch đại gen mục tiêu thông qua phương pháp PCR-SSR:
Sản phẩm PCR được khuếch đại thông qua microsatellite (SSR) theo phương pháp của IRRI (1996) [49] và Nguyễn Thị Lang (2002) [9].
Các thành phần hóa chất cho 15µl mẫu phản ứng PCR được chuẩn bị bao gồm: 8,5µl nước cất hai lần; 1,5µl dung dịch đệm cho PCR (10xTB buffer) (200mM Tris-HCl (pH = 8,0-8,5), 500mM KCl và 15mM MgCl2); 1µl dung dịch 1mM dNTP; 1µl dung dịch mồi xi và mồi ngược (5µM); 1µl dung dịch Taq DNA polymerase (4 U/µl) và 2µl DNA tổng số (35 ng/µl).
Sản phẩm PCR được khuyếch đại bằng máy thermal cycler 9600 (Perkin Elmer, USA) theo chương trình SSR được thiết lập như sau:
1. 94°C trong 5 phút (khởi đầu biến tính) 2. 35 chu kỳ với các bước sau:
94°C trong 30 giây (biến tính, tách đơi mạch kép DNA) 55°C trong 30 giây (ủ mồi)
72°Ctrong 45 giây (kéo dài)
3. 72°C trong 5 phút (kết thúc giai đoạn kéo dài) 4. Trữ ở 4°C.
Kiểm tra sản phẩm PCR trên bản gel:
Chuẩn bị gel theo thành phần ở. Dung dịch gel được đun sôi đến khi dung dịch chuyển sang trong suốt và để nguội với nhiệt độ 50-60oC. Dung dịch gel được đổ nhẹ từ từ ra khay, chú ý tránh bọt khí. Khi gel cứng rút lấy các lược và khung chắn ra khỏi gel.
Dùng 5-10µl dung dịch nhuộm (98% formanide, 10 nm EDTA; 0,025% bromo phenol; 0,025% xylene cyanol) trộn đều vào mẫu PCR. Bơm mẫu vào các lỗ giếng. Chạy điện di nằm khoảng 1-2 giờ tùy thuộc vào đặc tính từng cặp mồi.
Nhuộm gel trong dung dịch có ethidium bromide 0,5% khoảng 10-20 phút. Chụp gel dưới tia UV và đọc kết quả hiện thị trên màn hình.
Bảng 2.2. Các thành phần của gel polyacrylamide và agarose đƣợc sử dụng
Gel polyacrylamide 6% Gel agarose 3%
Thành phần Thể tích Thành phần Thể tích
Nước cất 78,9 ml Nước cất 98 ml
10X TBE buffer 5,0 ml 50X TAE buffer 2 ml
(Nguồn: IRRI, 2011; Nguyễn Thị Lang, 2002) [49], [9].
Lai tạo lúa trong nhà lƣới
Chọn bố mẹ: khi cây lúa bắt đầu trổ bông, cây lúa xanh, khỏe, cứng cáp, không
sâu bệnh. Đối với cây mẹ, bông phải trổ khỏi bẹ từ 50- 60%. Đối với cây bố, bông lúa trổ vươn ra khỏi bẹ và các hoa lúa nở để lộ các nhị đực vàng ra bên ngoài vỏ trấu.
Hình 2.1. Vật liệu bố mẹ đƣợc chuẩn bị
Khử đực trên cây mẹ: thời gian khử đực thường vào lúc chiều mát (khoảng 15
đến 17 giờ). Bông lúa được tách nhẹ nhàng ra khỏi bẹ địng, sau đó được xử lý bằng cách dùng kéo cắt bỏ các hoa đã nở ở chóp bơng (nhị đực đã phơi ra) và những hoa còn non ở cuối bơng. Các hoa cịn lại được cắt xiên theo viền vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Thao tác này cần nhẹ nhàng, tránh làm vỡ bao phấn, làm rơi hạt phấn lên đầu nhụy. Các nhị đực được loại bỏ ra khỏi vỏ trấu bằng dụng cụ gấp hạt phấn (ben). Các bông lúa đã khử đực được bao bọc lại bằng giấy bóng mờ, khơng thấm nước, cố định và ghi thông tin lên bao giấy.
10% APS 1,0 ml
TEMED 100,0 µl
Hình 2.2. Khử đực trên cây mẹ
Cách phủ phấn: thời gian phủ phấn lúc có nắng tốt (thường khoảng 9-10 giờ).
Các bông cho phấn hoa được chọn lựa và cắt cần thận bằng kéo. Sau đó, rắc nhẹ nhàng phấn hoa lên các hoa của cây mẹ đã được khử đực.
Chăm sóc bơng lai: kiểm tra hạt lai sau 3 - 4 ngày phủ phấn. Nếu bầu nỗn bắt đầu phình to chứng tỏ sự thụ phấn đã thành công, ngược lại, bông lúa sẽ bị khô và trắng. Hạt lai sẽ chín khi màu hạt chuyển sang vàng và được thu hoạch vào khoảng 25- 30 ngày sau khi thụ phấn. Hạt được sấy ở 38oC trong 3 ngày.
2.3.2. Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai F1