Dụng cụ, thiết bị

- Các dụng cụ thủy tinh nhƣ: Bình định mức thủy tinh, cốc thủy tinh, ống nghiệm, pipet các loại....

- Máy quang phổ UV-VIS 1700 PC – Shimazu (Nhật Bản) có kết nối máy tính, khả năng quét phổ trong khoảng bƣớc sóng 190nm – 900 nm, cuvet thạch anh chiều dày l = 1cm.

- Cân phân tích Scientech SA 210 độ chính xác 0,0001g.

2.4. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

2.4.1. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.

2.3.1.1. Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện đƣợc coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phƣơng trình hồi quy có công thức nhƣ sau:

3.Sy LOD =

B (2.1) Trong đó:

Sy: là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đƣờng chuẩn.

B: độ dốc của đƣờng chuẩn chính là độ nhạy của phƣơng pháp trắc quang.

2.3.1.2. Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lƣợng đƣợc coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lƣơng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu  95% và thƣờng ngƣời ta sử dụng công thức:

y 10.S LOQ =

B (2.2)

2.4.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp đối với các hỗn hợp ACE, LOR và DEX tự pha thông qua sai số tƣơng đối RE. Sai số tƣơng đối của các phép phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán đƣợc với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:

Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C (2.3) Trong đó:

RE% là sai số tƣơng đối của phép xác định nồng độ các cấu tử. CTính toán là nồng độ tính toán đƣợc từ chƣơng trình lọc Kalman.

C 0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch ACE, LOR hoặc DEX trong hỗn hợp.

- Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cƣ́u thông qua độ thu hồi bằng phƣơng pháp t hêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) đƣợc tính theo công thƣ́c sau:

C - T Re = .100% a a C v (2.4)

Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL) của dung dịch ACE, LOR hoặc DEX xác định đƣợc trong mẫu sau khi thêm chuẩn;

Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch ACE, LOR hoặc DEX xác định đƣợc trong mẫu khi chƣa thêm chuẩn.

A: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn ACE, LOR hoặc DEX thêm vào mẫu (đã biết).

- Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD).

    n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C   (2.5) RSD .100 (%) S C  (2.6)

Trong đó: Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch ACE, LOR hoặc DEX tính đƣợc lần thứ i;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

C là giá trị nồng độ trung bình tính đƣợc sau n lần xác định; k là số bậc tự do.

2.4.3. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê

Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ đƣợc tính theo công thức :

P,k

t .S X ± ε = X ±

n (2.7)

Trong đó : tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k đƣợc tra trong bảng ;

X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cƣ́u; S là độ lệch chuẩn ;

n là số phép đo.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của acetaminophen, loratadin và dex tromethorphan hydrobromit

Để có thể xác định đƣợc acetaminophen (ACE), loratadin (LOR) và dextromethorphan hydrobromit (DEX) bằng phƣơng pháp trắc quang thì acetaminophen, loratadin và dextromethorphan hydrobromit phải hấp thụ quang trong khoảng bƣớc sóng khảo sát. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ phân tử và tìm bƣớc sóng cực đại của acetaminophen, loratadin và dextromethorphan hydrobromit.

Pha dung dịch ACE nồng độ 8 µg/mL, LOR và DEX nồng độ 10 µg/mL trong các bình định mƣ́c 25 mL. Tiến hành quét phổ của các dung dịch đó trong k hoảng bƣớc sóng từ 200 đến 900 nm. Kết quả phổ hấp thụ quang phân tử đƣợc thể hiện ở hình 3.1 :

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn ACE( 1), LOR (2), DEX (3)

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy ACE có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 244 nm, LOR có độ hấp thụ quang cực đại tại bƣớc sóng λ = 273 nm còn DEX có độ hấp thụ quang cực đại tại λ = 278 nm. Trên cơ sở khảo sát thấy rằng trong khoảng bƣớc sóng 285-900 nm thì ACE, LOR và DEX gần nhƣ không hấp thụ ánh sáng còn trong khoảng bƣớc sóng 200-210 nm thì độ hấp thụ quang A lớn, do đó

chúng tôi lựa chọn khoảng bƣớc sóng để thực hiện các phép đo độ hấp thụ quang của dung dịch ACE, LOR và DEX là khoảng 210-285 nm để tiến hành các nghiên cƣ́u tiếp theo.

3.2. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX vào pH

Pha 3 dãy dung dịch gồm 9 mẫu dung dịch ACE và DEX có nồng độ 8 µg/mL, 9 mẫu dung dịch LOR có nồng độ 10 µg/mL trong các môi trƣờng HCl, H2SO4, HNO3 có pH=1, pH=2, pH=3.

Đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng cƣ̣c đại của ACE là 244 nm, của LOR là 273 nm và của DEX là 278 nm ở thời điểm 30 phút sau khi pha và ở nhiệt độ 250

C. Kết quả độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX trong các môi trƣờng khác nhau trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1.Độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX ở các giá trị pH

Môi trƣờng HCl HNO3 H2SO4

(3)

(1)

(2)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn pH 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A ACE 0,536 0,535 0,538 0,622 0,306 0,783 0,154 0,133 0,190 LOR 0,233 0,221 0,251 0,196 0,192 0,041 0,219 0,223 0,229 DEX 0,047 0,044 0,045 0,055 0,054 0,047 - 0,037 0,018 Nhận xét : Trên cơ sở kết quả khảo sát chúng tôi thấy rằng: độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX ổn định và đạt cƣ̣c đại trong môi trƣờng axit HCl pH=1. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng để nghiên cứu cho ACE, LOR và DEX là dung dịch HCl có pH = 1.

3.3. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo nhiệt độ

Pha dung dịch ACE và DEX có nồng độ 8 g/mL, dung dịch LOR có nồng độ 10 µg/mL trong HCl 0,1M. Sau khi pha dung dịch 30 phút ta đo độ hấp thụ quang của dung dịch ACE ở bƣớc sóng= 244 nm, LOR ở bƣớc sóng

= 273 nm, DEX ở bƣớc sóng = 278 nm, ở nhiệt độ từ 250

C đến 400C. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2:

Bảng 3.2 . Độ hấp thụ quang của dung dịch ACE, LOR và DEX theo nhiệt độ

Nhiệt độ (0 C) 25 30 35 40 A ACE 0,533 0,548 0,562 0,529 LOR 0,221 0,230 0,212 0,210 DEX 0,042 0,047 0,046 0,045 Từ kết quả ở bảng 3.2, xây dựng sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo nhiệt độ, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.2. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của dung dịch ACE(1), LOR (2), DEX(3) vào nhiệt độ

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.2 nhận thấy , độ hấp thụ quang của dung dịch ACE, LOR và DEX ổn định trong khoảng nhiệt độ 25 đến 400C. Do đó, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ để tiến hành các thí nghiệm là nhiệt độ phòng (25  300C).

3.4. Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo thời gian

Pha dung dịch ACE và DEX có nồng độ 8 g/ml, dung dịch LOR có nồng độ 10 µg/ml trong HCl 0,1M. Tiến hành đo độ hấp thụ quang ở 250

C của dung dịch ACE ở bƣớc sóng= 244 nm, LOR ở bƣớc sóng = 273 nm, DEX ở bƣớc sóng = 278 nm, cứ 5 phút đo một giá trị. Kết quả đo độ hấp thụ quang của các dung dịch theo thời gian đƣợc trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch ACE, LOR và DEXtheo thời gian

Thời gian (phút) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A ACE 0,524 0,525 0,528 0,525 0,530 0,534 0,534 0,535 0,535 LOR 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 DEX 0,047 0,047 0,047 0,047 0,047 0,047 0,047 0,047 0,047 Thời gian 50 55 60 65 70 75 80 85 90

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (phút) A ACE 0,535 0,529 0,534 0,534 0,533 0,533 0,533 0,534 0,534 LOR 0,233 0,233 0,233 0,232 0,233 0,233 0,232 0,233 0,232 DEX 0,047 0,047 0,046 0,046 0,046 0,047 0,047 0,046 0,046 Tƣ̀ kết quả ở bảng 3.3 biểu diễn sƣ̣ phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào thời gian. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3. Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang

của dung dịch ACE(1), LOR (2), DEX(3) theo thời gian

Nhận xét: Tƣ̀ kết quả ở bảng 3.3 và hình 3.3 nhận thấy, trong khoảng thời gian từ 30  90 phút sau khi pha, độ hấp thụ quang của các dung dịch ACE, LOR và DEX tƣơng đối ổn định . Sƣ̣ thay đổi chủ yếu ở khoảng thời gian 5

 25 phút sau khi pha, tuy nhiên sƣ̣ thay đổi là không đáng kể. Nhƣ vậy, có thể nói các dung dịch ACE, LOR và DEX có độ hấp thụ quang ổn định trong khoảng thời gian từ 30  90 phút sau khi pha. Tuy nhiên trong thực tế các phép đo độ hấp thụ quang đƣợc thƣc hiện từ 30  40 phút sau khi pha. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian thích hợp để đo sự hấp thụ quang của các dung dịch là 30 phút sau khi pha.

3.5. Kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ACE, LOR và DEX

Để áp dụng phƣơng pháp trắc quang dùng phổ toàn phần thì độ hấp thụ quang của các chất trong hỗn hợp phải tuân theo định luật cộng tính , do đó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cần kiểm tra tính cộng tính độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ACE, LOR và DEX trong khoảng bƣớc sóng tối ƣu đã lƣ̣a chọn tƣ̀ 210-285 nm.

Pha dung dịch ACE, LOR và DEX có nồng độ 8 µg/mL và các hỗn hợp của chúng trong dung dịch HCl 0,1M. Sau khi pha 30 phút ta tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bƣớc sóng từ 210 nm đến 285 nm và ở nhiệt độ 250

C, cứ 0,5 nm ghi một giá trị . Cộng phổ riêng phần của cả 3 dung dịch chuẩn ACE, LOR và DEX rồi so sánh với phổ hỗn hợp của 3 dung dịch. Đánh giá sự cộng tính độ hấp thụ quang thông qua tính sai số tƣơng đối và sai số tuyệt đối . Kết quả tính toán sƣ̣ cộng tính độ hấp thụ quang ở một số bƣớc sóng cơ bản đƣợc trình bày tại bảng 3.4 (Kết quả đầy đủ đƣợc trình bày ở phụ lục 2).

Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của ACE, LOR, DEX và hỗn hợp ở một số bước sóng



(nm)

AACE ALOR ADEX ALT ATN

Sai số tuyệt đối Sai số tƣơng đối(%) 210 0,3947 0,6141 0,3667 1,3755 1,3655 0,01 0,73

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 220 0,2570 0,3405 0,1965 0,7939 0,7739 0,02 2,52 230 0,3746 0,2306 0,1346 0,7397 0,7227 0,017 2,29 240 0,4734 0,2146 0,0221 0,7100 0,7290 -0,019 -2,68 250 0,4439 0,2014 0,0052 0,6506 0,6616 -0,011 -1,69 260 0,2742 0,1751 0,0127 0,4620 0,4420 0,02 4,33 270 0,1321 0,1832 0,03108 0,3464 0,3364 0,01 2,89 280 0,0846 0,1831 0,0467 0,3145 0,3055 0,009 2,87

Nhận xét: Số liệu bảng 3.4 và phụ lục 2 cho thấy, trong khoảng bƣớc sóng 210- 285 nm sai số cộng tính độ hấp thụ quang của hỗn hợp ACE, LOR và DEX mắc phải không lớn. Sai số tuyệt đối có giá trị từ -0,019 ÷ 0,02 còn sai số tƣơng đối có giá trị lớn nhất là 6,78%. Nhƣ vậy, có thể xem nhƣ phổ của dung dịch ACE, LOR và DEX có tính chất cộng tính trên toàn phổ, từ đó cho phép xác định đồng thời ACE, LOR và DEX bằng phƣơng pháp trắc quang dùng phổ toàn phần.

3.6. Khảo sát khoảng tuyến tính sự tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và xác định LOD, LOQ của dung dịch ACE, LOR, DEX.

3.6.1. Khảo sát khoảng tuyến tính của ACE

Pha một dãy dung dịch ACE trong HCl 0,1M có nồng độ tăng dần từ 0,2  30 g/mL. 30 phút sau khi pha, tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch tại bƣớc sóng tối ƣu của ACE là 244 nm, ở nhiệt độ 250

C. Kết quả đo độ hấp thụ quang của dung dịch đƣợc trình bày ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Độ hấp thụ quang của dung dịch ACE ở các giá trị nồng độ

CACE (g/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5

A 0,017 0,031 0,050 0,062 0,077 0,109

CACE (g/mL) 2,0 2,5 3.0 3,5 4,0 5,0

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CACE (g/mL) 6,0 8,0 10,0 15,0 20,0 25,0

A 0,399 0.536 0,671 0,980 1,313 1,681

Tƣ̀ kết quả đo quang ở bảng 3.5. Tiến hành xây dƣ̣ng sƣ̣ phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ ACE. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4:

Hình 3.4. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ ACE

Nhận xét: Qua bảng 3.5 và hình 3.4 ta thấy khi nồng độ của ACE lớn hơn 30 μg/mL thì độ hấp thụ quang A > 2, khi đó sai số đo quang là lớn. Trong khoảng nồng độ 0,2  25 g/mL thì độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính với nồng độ. Do vậy, ta chỉ khảo sát độ hấp thụ quang của ACE trong khoảng nồng độ 0,2  25 g/mL.

3.6.2. Xác định LOD và LOQ của ACE

Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.4 nhận thấy: trong khoảng nồng độ của ACE từ 0,2  25,0 g / mL độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ với R2 = 0,9996. Do đó, có thể chọn đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0,2  1,0

g/mL làm phƣơng trình tính LOD và LOQ theo công thƣ́c (2.1) và (2.2).

Bảng 3.6.Kết quả xác định LOD và LOQ của ACE

B Sy LOD LOQ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Kết luận: Khoảng tuyến tính của ACE trong dung môi HCl 0,1M là 1,3

 25,0 g/mL.

3.6.3. Khảo sát khoảng tuyến tính của LOR

Pha một dãy dung dịch LOR trong dung dịch HCl 0,1M có nồng độ tăng dần từ 1,0  80 g/mL. 30 phút sau khi pha, tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch tại bƣớc sóng tối ƣu của LOR là 273 nm và ở nhiệt độ 250

C. Kết quả đo độ hấp thụ quang của dung dịch đƣợc trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Độ hấp thụ quang của dung dịch LOR ở các giá trị nồng độ

CLOR(g/mL) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 5,0 6,0 8,0 A 0,025 0,033 0,043 0,052 0,063 0,075 0,101 0,116 0,139 0,187 CLOR(g/mL) 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

A 0,238 0,336 0,443 0,548 0,641 0,872 1,088 1,335 1,553 1,775 Tƣ̀ kết quả đo quang ở bảng 3.7. Tiến hành xây dƣ̣ng sƣ̣ phụ thuộc của độ hấp

thụ quang A vào nồng độ LOR. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5.Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ LOR

Nhận xét: Qua bảng 3.7 và hình 3.5 nhận thấy khi nồng độ LOR nằm