a. Cơ chế của quá trình lên men rượu
Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1 ml dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽđược hình thành.
Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào môi trường. CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800 mmHg, nhiệt độ 25 - 300C là 0,856 - 0,837 lít CO2 trong một lít nước. Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường, điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men.
Khí CO2ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men, khi lên men đều ảnh hưởng dến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men.
b. Động học của quá trình lên men rượu
Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men, hoặc gián tiếp xác định lượng rượu tạo thành và lượng CO2 thoát ra trong một đơn vị thời gian. Cũng có thể xác định nhanh tốc độ lên men bằng cách đo nồng độ biểu kiến của nồng độ dịch lên men.
Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính:
Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể.
Thời kỳ 2: đây là thời kỳ lên men chính. Chiếm khoảng 60 - 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại.
Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được.
Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Trong giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi khoảng 1 độ (Brix, %) tùy loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất.
Sự tồn tại của thời kỳ lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch đường hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột.
Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường có trong dịch lên men là 100% thì 4-6% là dạng chất không tan, 75-77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin. Trong giai đoạn lên men, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự thủy phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy vậy chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy chu kỳ lên men dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men. Tuy vậy tùy theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ glucid của sựđường hóa, phương pháp lên men, nhà sản xuất cũng sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ.
c. Cơ chế quá trình chuyển hóa các chất trong lên men rượu nếp than
Các quá trình vi sinh vật
Thực chất của quá trình này là quá trình sinh sản và sinh trưởng của vi sinh vật. Quá trình này xảy ra rất nhanh ở giai đoạn đầu lên men, khi ta cho bánh men thuốc bắc vào
nguyên liệu lên men. Sự phát triển mạnh các vi khuẩn ở giai đoạn này, kéo theo sự tạo thành một số acid hữu cơ. Kết quả là pH môi trường giảm xuống tạo điều kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển. Song song đó các loài nấm men bắt đầu phát triển, tuy tốc độ phát triển của chúng có yếu hơn sự phát triển của nấm mốc.
Các loài nấm mốc chỉ phát triển mạnh trong giai đoạn đường được tạo thành. Hay đúng hơn là cuối của giai đoạn nấm mốc phát triển.
Việc phân ra các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm mốc và nấm men một cách thật rõ ràng là điều rất khó khăn. Vì thực tế sự phát triển của các loài vi sinh vật trong khối lên men diễn ra đồng thời. Chỉ có một điều khẳng định là sự phát triển đó thường không cùng một mức độ. Sự phát triển của một số vi khuẩn, nấm mốc đòi hỏi sự tồn tại trong môi trường một lượng O2 nhất định. Chính vì thế các loài vi sinh vật này phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Nấm men cũng cần sự có mặt của O2 để tăng sinh khối. Tuy nhiên mức độđó không cao như của nấm mốc. Mặt khác nấm men phát triển cần đường, do đó nó cần phải có thời gian để nấm mốc chuyển hóa đường từ tinh bột.
Các quá trình sinh hóa
Trong quá trình lên men rượu nếp than xảy ra ba quá trình sinh hóa cơ bản.
Quá trình chuyển hóa đường và các thành phần khác thành các acid hữu cơ
Trong đó có hai quá trình tạo acid hữu cơ cơ bản. Đó là quá trình tạo acid acetic và quá trình tạo acid lactic. Quá trình tạo acid lactic mạnh hơn quá trình tạo acid acetic. Cả hai quá trình này xảy ra với cường độ không mạnh vì giai đoạn đầu lượng đường trong khối lên men chưa cao nên việc chuyển hóa đó không xảy ra mạnh.
Quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường
Do sự phát triển của nấm mốc và sự phát triển của nấm men Endomycopsis, tinh bột được chuyển thành đường. Các loài nấm mốc và nấm men này trong quá trình phát triển tạo ra rất nhiều enzyme amylase, glucoamylase. Các enzyme này hoạt động rất thuận lợi trong giai đoạn đầu và được kéo dài suốt thời gian sau này. Bản chất của các enzyme này là các enzyme cảm ứng, do đó nguyên liệu là loại chứa nhiều tinh bột, kích thích quá trình sinh tổng hợp rất mạnh mẽ. Điểm quan trọng thứ hai cần đề cập đến là các enzyme này chịu sự điều khiển bởi sản phẩm cuối cùng là glucose. Bình thường thì glucose sẽ ức chế phản ứng thủy phân tinh bột. Nhưng các loài nấm mốc
Mucor rouxi, Rhizopus delemar, các loài nấm men thuộc Endomycopsis vừa có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, glucoamylase vừa có khả năng chuyển hóa đường để tạo thành cồn. Kết quả là lượng đường glucose được tạo thành bao nhiêu, ngay lập tức được chuyển hóa hết thành cồn, một phần được phục vụ cho sinh sản và phát triển của chính các loài vi sinh vật đó. Do đó trong khối lên men này thường không xảy ra cơ chế kìm hãm ngược bởi glucose.
Quá trình chuyển hóa đường thành cồn
Quá trình này được thực hiện bởi:
Saccharomyces sp.
Mucor và Rhizopus sp.
Trong đó các loài nấm men Saccharomyces đóng vai trò cơ bản.
Song song với quá trình này là các quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác.
Điều đặc biệt lưu ý là tất cả các quá trình chuyển hóa được xảy ra xen kẽ nhau, hỗ trợ nhau và tạo nên một quá trình hài hòa, để cuối cùng tạo ra sản phẩm ta thu được không chỉ có nước và cồn mà là một hỗn hợp sản phẩm bao gồm rất nhiều thành phần khác nhau. Chính vì thế rượu nếp than là một loại rượu có hương vịđặc biệt và giá trị cảm quan khác rất riêng.
2.3.3. Các yếu tốảnh hưởng đến quá trình lên men rượu
a. Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men
Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men. Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu hình thành nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nồng độ dịch đường cũng tạo điều kiện cho lên men vi khuẩn phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men.
Bình thường trong dịch lên men thường có nồng độ chất khô từ 16 - 18% (tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương với 13 - 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường đối với lên men lactic.
b. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và lượng tế bào nấm men
Trong trường hợp có đầy đủ hoặc thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Tuy nhiên cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme tăng quá cao, tốc độ phản ứng bị chậm lại. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme theo phương trình tổng quát sau:
V = K [E]
Trong đó: V: vận tốc phản ứng.
K: hằng số tốc độ phản ứng. E: nồng độ enzyme.
Ngoài ra số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt, hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tăng lên. Nếu lượng men cho vào ít quá thì quá trình lên men diễn ra chậm, sinh khối tế bào nấm men thấp là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. Ngược lại nếu số lượng tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ chất dinh dưỡng cho tế bào nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ bị chết, làm cho sản phẩm có mùi vị lạ, lãng phí đi một lượng men không có ích.
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tốảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men. Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mình. Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 - 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20 - 220C sẽ hạn chếđược sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8 - 10 giờ, nhiệt độ lên men sẽđến 28 - 300C, tiếp dó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C, men hoang dại phát triển nhanh hơn saccharomyces từ 2 - 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 - 380C chúng phát triển nhanh đến 6 - 8 lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng
Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 - 450C. Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết.
Tuy nhiên nhiệt độ ngoài ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của nấm men, còn gây nên một số phản ứng phụ như: gây nên sự bay hơi làm tổn thất cồn, mất hợp chất gây mùi thơm, hình thành nên các sản phẩm phụ khác khi lên men ở nhiệt độ quá cao. Do đó thường tiến hành lên men ở nhiệt độ thích hợp để tránh hiện tượng tổn thất cồn do bay hơi, giữ được mùi thơm đặc trưng của rượu và tránh được sự phát triển của vi sinh vật ưa nhiệt.
d. Ảnh hưởng của pH
Nồng độ H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định - trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của canh trường.
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 - 8 nhưng thích hợp nhất là trong khoảng pH = 4 - 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn. Khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcol etylic là 4,5 - 5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 - 5,2, nhằm kết hợp giữ cho enzyme amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men. Chính vì vậy trong lên men rượu, để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn (lactic, nấm men hoang dại,…) người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần (thuần hóa) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển.
Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường một loại acid thích hợp nào đó sao cho anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh mẽ đến trung tâm hoạt động của nấm men, không ảnh hưởng đến chất lượng rượu thành phẩm và sức khoẻ người tiêu dùng.
e. Ảnh hưởng của nồng độ rượu
Thường trong dịch lên men có khoảng 4 - 6% rượu. Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến
