2 .3 Sự phát triển của acid lactic trong sản xuất rượu vang
3.2.6. Biến đổi cảm quan
Những nghiên cứu về những ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến các chỉ tiêu cảm quan, đặc biệt về vị (điển hình là vị chua) được thể hiện rõ nhất và có thể được định tính cũng như định lượng dễ dàng. Tuy nhiên, phần lớn sự đánh giá các tác động của quá trình này đối với các chỉ tiêu khác như hương và cấu trúc thì ít được đề cập đến. Hầu hết các tác giả chỉ tìm ra được những đóng góp của lên men malolactic trong việc cải thiện hương và vị của rượu vang nhưng vẫn chưa đánh giá được mức độ phù hợp của quá trình này đối với tính chất cảm quan về hương vị của rượu vang. Hiện nay, với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích hóa lý, rất nhiều tác giả đã và đang tiếp tục nghiên cứu những ảnh hưởng có ý nghĩa của quá trình lên men malolactic lên những tính chất cảm quan của rượu vang. Nhìn chung, những biến đổi cảm quan của vang sau lên men malolactic bao gồm:
+ Sự giảm hàm lượng axit malic kèm theo sự giảm vị chua gắt của sản phẩm do axit này gây nên.
+ Lên men malolactic có thể làm tăng hương trái cây tự nhiên và hương bơ nhưng có thể làm giảm mùi của cây cỏ. Sự gia tăng hương trái cây tự nhiên là kết quả của sự hình thành các ester đặc trưng của vang như ethylacetate và ethyllactate. Sự tăng nhẹ mùi bơ cũng được biết là do sự có mặt của diacetyl trong vang. Sự giảm mùi cỏ được giải thích bởi sự phân giải acetaldehyde bởi vi khuẩn malolactic.
+ Bên cạnh các chỉ tiêu về hương vị, nhiều tác giả còn tin rằng vang sau lên men malolactic có thể cải thiện được cấu trúc và giữ được hậu vị kéo dài hơn. Các tác động này được kích thích bởi sự sản sinh ra các polyol và polysaccharide nhờ vi khuẩn malolactic trong rượu vang.
Ngoài ra, một số vang sau lên men còn thể hiện một số mùi, vị và cấu trúc riêng biệt như: mùi hoa, mùi hạt, mùi men, mùi gỗ sồi, mùi khói, mùi đất, vị đắng.
3.3. Yếu tố ảnh hưởng đến lên men malolactic [9, 14, 16] 3.3.1. PH
Một trong những yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến tiến trình lên men malolactic chính là pH pH tác động lên dịch lên men trước và sau lên men malolactic bởi các khả năng sau:
- pH thấp làm chậm lại quá trình lên men và có xu hướng trì hoãn quá trình lên men khởi đầu.
- Ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của nấm men - Ảnh hưởng đến sự tồn tại của sinh vật
- Ảnh hưởng đến chuyển hóa của các chủng đang phát triển
- Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ pH bằng 3,0 – 3,5.
Độ pH cao thường được tìm thấy trong nước ép và ít ảnh hưởng đến tốc độ lên men, hoặc lên sự tổng hợp và giải phóng của các hợp chất thơm bởi nấm men. Chỉ có tại giá trị pH (3,0) là cản trở quá trình lên men.
sẽ giúp cho việc xác định sự hiện diện của loài vi khuẩn malolactic tồn tại trong canh trường cũng như việc lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp. Điều này giúp nhà sản xuất kiểm soát tốt hoạt động lên men malolactic.
3.3.2. SO2
SO2 được tổng hợp bởi các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae là nhiều
nhất, nhưng trong hầu hết trường hợp, nó liên kết với các hợp chất hữu cơ trong nấm men.
Hầu hết các vi khuẩn malolactic đều tỏ ra mẫn cảm với SO2 và chúng có thể bị ức chế khi hàm lượng SO2 tự do nằm trong khoảng 10-20 mg/L hoặc cao hơn. Thông thường hàm lượng SO2 tổng số tối đa được cho phép (để tiến hành lên men malolactic) ở trong vang là 70 mg/L (đối với vang đỏ) và 40 mg/L (đối với vang trắng).
3.3.3. Oxy
Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống
Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong môi trường đủ
lượng oxy nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối.
Trường hợp thiếu oxy (kỵ khí) nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và chủ yếu là lên men.
Oxy có ảnh hưởng đến cơ chế trao đổi chất của một số loài vi khuẩn đặc biệt là các loài lên men lactic dị hình. Sự có mặt của oxy có thể làm tăng hàm lượng axit acetic, các aldehyde, acetoin, diacetyl, các rượu bậc cao...ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản phẩm.
3.3.4. Ethanol
Ethanol làm chậm quá trình tăng trưởng của vi khuẩn. Nó thậm chí có hiệu quả ức chế quá trình lên men malolactic.
- Hàm lượng cao làm chậm quá trình lên men rượu malolactic - L. trichodes có thể phát triển trong rượu vang tại ethanol 20%.
- Một một vài chủng Oenococcus oeni có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy taị nồng độ alcohol 15%. Khả năng chịu Ethanol dường như giảm khi tăng nhiệt độ và giảm giá trị pH.
Tuy nhiên, ở nồng độ thấp (1,5%), ethanol ưu tiên cho vi khuẩn phát triển Các cơ chế ức chế của ethanol chưa được biết một cách rõ ràng, nhưng có liên quan đến việc thay đổi tính chất bán thấm của màng của tế bào. Những thay đổi này có thể tăng cường dòng ion H+ và làm mất các thành phần tế bào (Graça da Silveira và cộng sự, 2002), giảm nồng độ chất béo trung tính, tăng tỷ lệ glycolipids, có tương quan với nồng độ rượu cao (Desens và Lonvaud- Funel, 1988). Khả năng chống chịu Ethanol của vi khuẩn cũng có tương quan với sự tổng hợp tăng cường của một số phospholipid (Phos-phoethanolamine và sphingomyelin).
Khi tăng nồng độ cồn lên 11-13% thì tỷ lệ decarboxyl hóa axit malic giảm 80% (Lafon-Lafourcade, 1975).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên tốc độ phân giải acid malic của vi khuẩn L.oenos
Ethanol
(%) (% bị phân giải trong 48 giờ)L-Malic acid
0 1 2 4 8 12 14 100 94.9 95.2 94.9 89.8 69.1 71.8 3.3.5. Nhiệt độ
Nhiệt độ lên men có ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm.
Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rượu vang đã xác định được khoảng nhiệt độ lên men rượu vang trắng thích hợp là 15 – 300C, nếu lên men ở những thang độ thấp hơn thì càng tốt. Còn lên men rượu vang đỏ (nước quả lẫn với xác quả) phải chiết xuất các chất thơm và polyphenol từ vỏ quả nên cần thang độ cao hơn, thường là 250C.
- Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn có thể thấp, đường sót còn nhiều và hương vị của sản phẩm có khi không tốt.
- Hầu hết các chủng Oenococcus oeni phát triển rất chậm hoặc không ở nhiệt độ dưới 15 ºC.
- Dù nhiệt độ trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn, tác động quan trọng nhất là decarboxyl hóa axit malic. Quá trình decarboxyl hóa xảy ra tối đa giữa khoảng nhiệt độ 20 và 25ºC.
- Ở nhiệt độ dưới 10ºC, quá trình decarboxyl hóa cơ bản chấm dứt.
- Nhiệt độ khoảng 25ºC làm suy giảm hoạt động của Ooeni nhanh chóng. (Lafon-Lafourcade và cộng sự, 1983.), nhưng có thể thúc đẩy sự tăng trưởng của
Pediococci và Lactobacilli.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến quá trình lên men malolactic đối với O.oeni
Nhiệt độ Ảnh hưởng 100C (500F) 12-130C (54-550F) 150C (590F) 20-250C (68-770F) >300C (>860F)
Lên men malolactic kéo dài nhiều tháng (có thể xem như quá trình decarboxyl hóa acid malic không diễn ra)
Lên men kéo dài trong vài tuần Bắt đầu có dấu hiệu lên men chậm
Nhiệt độ tối thích cho lên men malolactic
Lên men malolactic bị đình chỉ, vi khuẩn ML có thể bị chết
3.3.6. Axit hữu cơ
Trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn lactic hấp thụ rất nhiều các hợp
chất. Đôi khi, điều này có thể ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic.
Nấm men vang có thể hoạt động trong môi trường có 8÷10g/l axit (với môi trường này hầu như các loài vi khuẩn đều bị ức chế)
3.3.7. Các hợp chất chứa nitơ
Đa số trong nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men. Tuy nhiên cũng có trường hợp không đủ nguồn nitơ do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ. Trong trường hợp này người ta thường dùng amon sulphat (NH4)2SO4. Cũng có thể dùng men tự phân cho thêm vào môi trường. Nếu dịch quả quá chua dùng tartrat amon-kali hay amon hydroxy trung hòa bớt axit.
Đối với dịch nhân giống hoặc hoạt hóa giống thì hỗn hợp các nguồn nitơ và các chất sinh trưởng rất có ý nghĩa.
Trong nước quả thường có đủ các chất khoáng đối với nhu cầu của nấm men. Vì vậy, không cần phải bổ sung thêm chất khoáng. Tuy nhiên trong nghiên cứu cũng như trong nhân giống có thể thêm nguồn phospho kali ở dạng muối phosphat và magie ở dạng muối sulfat.
Ngoài ra để chống oxy hóa nước quả, người ta có thể thêm hóa chất vào nước quả sau khi ép và trước khi lên men. Chất dùng rộng rãi là SO2 (anhydrit sunphurơ). SO2 là hóa chất được cho phép dùng trong sản xuất rượu vang ở hầu hết trên thế giới và có tác dụng nhiều mặt: chống oxy hóa, làm giảm hoặc tiêu diệt vi khuẩn có hại. Nguồn SO2 phổ biến trong rượu vang là natri sunfit Na2SO3. Không nên dùng quá liều lượng cho phép sẽ làm cho rượu vang có mùi khó chịu và diệt một số vi khuẩn có ích.
3.4. Phương pháp tiến hành lên men malolactic [13] 3.4.1 Giới thiệu
Trong nghề làm rượu vang trước đây, người ta thường gặp quá trình lên men malolactic xảy ra tự phát bởi một số loài vi khuẩn lactic có sẳn trên nguyên liệu hay trên các thiết bị sản xuất. Các loại rượu vang có độ chua cao thường tạo điều kiện thuận lợi cho các cầu khuẩn lên men malolactic dị hình phát triển, đặc biệt là các loại rượu vang không được sulfit hóa sau quá trình lên men chính. Hiện tượng này được nhiều nhà sản xuất vang quan tâm và sử dụng như một công đoạn lên men phụ trong quy trình sản xuất. Người ta có thể kiểm soát quá trình lên men bằng cách kiểm tra sự thay đổi độ chua hay hàm lượng axit malic trong vang. Khi vang đạt đến độ chua cần thiết thì quá trình lên men malolactic phải được kết thúc bằng cách sulfit hóa hoặc làm lạnh nhanh dịch sau lên men. Nhược điểm của việc lên men malolactic một cách tự phát là quá trình lên men diễn ra trong điều kiện khó kiểm soát; kèm theo đó là những rủi ro về mặt vi sinh do sự phát triển phức tạp của nhiều loài vi sinh vật khác nhau; cuối cùng là chất lượng sản phẩm tạo thành không ổn định.
khuẩn malolactic thuần khiết vào môi trường lên men. Có 2 phương pháp để cấy vi khuẩn giống vào môi trường:
- Cấy giống vi khuẩn trực tiếp vào môi trường. - Cấy giống vi khuẩn đã được hoạt hóa trước.
3.4.2. Phương pháp tiến hành
Phương pháp tiến hành
Lên men tự nhiên Cấy giống
Cấy trực tiếp Hoạt hóa trước
Đầu giai đoạn Giữa lên men chính Đầu giai đọan Đầu giai đọan lên men ethanol tàng trữ tàng trữ
3.4.2.1. Phương pháp cấy giống trực tiếp [13]3.4.2.1.1. Nguyên tắc 3.4.2.1.1. Nguyên tắc
Vi khuẩn malolacitc ở dạng canh trường bột rắn đã qua sấy thăng hoa (freeze- dries culture) được cấy trực tiếp vào môi trường. Lượng giống cấy cần thiết để bắt đầu quá trình chuyển hóa axit malic phải không được thấp hơn 106 tế bào/ml dịch lên men. Thời điểm cấy giống có thể tiến hành ở thời điểm bắt đầu lên men chính cùng với nấm men hoặc ở thời điểm bắt đầu tàng trữ.
3.4.2.1.2. Ưu điểm, nhược điểmƯu điểm: Ưu điểm:
- Có thể chủ động kiểm soát được quy trình sản xuất, xác định thời điểm bắt đầu và kết thúc lên men một cách dễ dàng.
- Các chủng vi sinh vật (thường ở dạng chế phẩm thương mại) đã được nghiên cứu về các đặc tính về hình thái, sinh lý, hoạt tính lên men malolactic phù hợp với từng điều kiện lên men nhất định. Hầu hết các chủng vi khuẩn này điếu có hoạt tính lên menmalolactic cao và có khả năng chống chịu tốt với những điều kiện khắc nghiệt của môi trường vang. Chúng có khả năng chịu được nồng độ ethanol rất cao
có thể lên đến 15,5%; pH rất thấp đến 3,1; chịu được nhiệt độ thấp nhưng không nhỏ hơn 140C) cũng như nồng độ SO2 cao. Điều này có thể giúp nhà sản xuất dễ dàng hơn trong việc lựa chọn chế phẩm thích hợp với điều kiện sản xuất của mình.
- Vì quá trình được kiểm soát nghiêm ngặt từ khâu cấy giống, lên men và thu nhận sản phẩm nên có thể hạn chế được sự phát triển không mong muốn của các loài vi sinh vật khác trong rượu vang (các vi khuẩn có sẵn trong nguyên liệu), cũng như những vi sinh vật tạp nhiễm. do đó, phương pháp này giúp nhà sản xuất giảm thiểu dược những rủi ro về mặt an toàn vi sinh.
- Việc cấy giống vào môi trường với số lượng thích hợp có thể tránh được những vấn đề liên quan đến sự thích nghi trong pha lag của vi khuẩn malolactic. Do đó, thời gian lên men có thể rút ngắn hơn so với việc lên men malolactic một cách tự phát.
Nhược điểm: phương pháp lên men trực tiếp vẫn còn tồn tại một số nhược
điểm chính như sau:
- Trong trường hợp lên men cùng với nấm men, cần phải đánh giá sự tương tác qua lại giữa nấm men và vi khuẩn. Các tương tác này có thể cộng sinh, cạnh tranh, kìm hãm hay trung lập, điều này còn tùy thuộc vào từng chủng nấm men và vi khuẩn sử dụng.
3.4.2.2. Phương pháp cấy giống đã được hoạt hóa trước [13]3.4.2.2.1. Nguyên tắc 3.4.2.2.1. Nguyên tắc
Đây là phương pháp sử dụng canh trường giống vi khuẩn malolactic thuần khiết đã được hoạt hóa trước trong môi trường nuôi cấy trung gian trước khi cấy vào rượu vang bán thành phẩm. Môi trường trung gian có bản chất tương tự môi trường lên men. Môi trường này vừa được dùng để nhân giống vừa tạo điều kiện cho vi khuẩn malolactic thích nghi một phần với môi trường vang trước khi tiến hành lên men thật sự.
Thời điểm cấy giống vào vang thường được tiến hành ngay khi kết thúc quá trình lên men ethanol. Theo phương pháp này quá trình lên men malolactic tiến hành nhanh và thuận lợi, có thể bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng cần cho vi
3.4.2.2.2. Ưu điểm, nhược điểm.Ưu điểm: Ưu điểm:
So với phương pháp trên, phương pháp này có ưu điểm hơn là:
Rút ngắn thời gian lên men do vi khuẩn đã được hoạt hóa và thích nghi trước với môi trường lên men. Việc hoạt hóa có thể tiến hành song song với quá trình lên men ethanol và malolactic. Ngoài ra do thời gian lên men được rút ngắn nên sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất không mong muốn bởi vi khuẩn (các acid bay hơi, diacetyl...) cũng bị hạn chế.
- Tiết kiệm lượng giống cấy do quá trình nhân giống và giống được thích nghi trước nên giảm thiểu được lượng tế bào bị ức chế và bị chết so với phương pháp cấy trực tiếp.
- Dễ điều khiển quá trình và các thông số công nghệ do giai đoạn lên men malolactic được thực hiện cách biệt với quá trình lên men ethanol.
Nhược điểm:
KẾT LUẬN CHUNG
Lên men malolactic đã từ lâu được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất rượu vang. Người ta sử dụng quá trình này như một giai đoạn lên men phụ trong quy trình sản xuất nhằm mục đích cải thiện và nâng cao chất lượng của rượu vang thành phẩm. Tuy nhiên kỹ thuật lên men malolactic truyền thống thường gặp rất nhiều khó khăn do điều kiện môi trường rượu vang không thuận lợi cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn lactic – tác nhân lên men malolactic trong sản xuất rượu vang. Điều này đòi hỏi nhà sản xuất phải có những kỹ năng và kinh nghiệm sản xuất nhất định để có thể diều khiển và kiểm soát quá trình này một cách hiệu quả.
Trên cơ sở đó, nhiều giải pháp kỹ thuật nhằm lên men malolactic thuận lợi hơn đã được nghiên cứu và phát triển. Những giải pháp trên bao gồm:
