Để tiến hành nghiên cứu về việc đưa ra phương pháp chẩn đoán đồng thời ba virus: gây bệnh đốm trắng (WSSV –White spot syndrome virus), bệnh còi (MBV –Monodon Baculovirus), bệnh teo gan tụy (HPV –hepatopancreatic virus) trên thủy sản, chúng tôi đã thiết kế ba cặp mồi đặc hiệu cho ba virus. Đầu tiên chúng tôi tiến hành download các trình tự gen của WSSV, HPV trên NCBI, sử
dụng chương trình ClustalX để tìm vùng bảo tồn cao nhất. Riêng MBV do bộ gen chưa được giải mã hoàn chỉnh theo đó chúng tôi sử dụng đoạn gen được nghiên cứu nhiều nhất để thiết kế mồi cho MBV. Khi đã tìm được cặp mồi thỏa mãn
điều kiện nằm trong vùng bảo tồn cao nhất cao, chúng tôi dùng chương trình Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của mồi trên vùng trình tự đích, và cuối cùng quyết định sử dụng ba cặp mồi sau: Bảng 2: Ba cặp mồi được thiết kế Primer Trình tự Độ dài Kích thước sản phẩm PCR(bp) WSSV F 5’ –TGTGACCAAGACCATCGAA- 3’ 19 280 WSSV R 5’ –CCACACCTTGAATGTTCCC- 3’ 19 280 MBV F 5’ –TCCCTGAGATACTATTTAGCAACA-3’ 24 585 MBV R 5’ –CTACTAACTGTCGTAGCGACACC- 3’ 23 585 HPV F 5’ –GTCACCTACAAGAARAGGAGG - 3’ 22 447 HPV R 5’ –TGTCTGAAAATCCTGATGCGT- 3’ 21 447 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI TRÊN LÍ THUYẾT
2.1Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các trình tự bằng ClustalX và BioEdit và BioEdit
Chúng tôi sử dụng phần mềm ClustalX và BioEdit nhằm thiết kế ba cặp mồi hoàn toàn đặc hiệu cho DNA của WSSV, MBV và HPV dựa trên việc sắp
gióng và tìm vùng bảo tồn cao nhất của các trình tự đựơc download về từ trang web NCBI.
Hình 17: ClustalX cặp mồi MBV
Theo như hình 16, 17, 18 và 19, hai cặp mồi của WSSV và MBV bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu. Tuy nhiên đối với cặp mồi của HPV chúng tôi thấy, mồi ngược bắt cặp hoàn toàn nhưng trên mồi xuôi có 1 vị trí không thể bắt cặp giữa mồi và trình tự DNA. Dù vậy nhưng do điểm này nằm giữa đoạn mồi nên chúng tôi đã sử dụng một nu thay thế (R). Các nu thay thế này giúp mồi bắt cặp chuyên biệt hơn với trình tự mục tiêu. Hiệu quảđặc hiệu của các cặp mồi sẽ được đánh giá chính xác hơn trong quy trình thực nghiệm.
Hình 18: ClustalX cặp mồi HPV
2.2 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu và khả năng nhân bản chọn lọc của mồi trên lý thuyết
Kết quả khảo sát trên Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) cho thấy mỗi cặp mồi được thiết kế cho mỗi loại virus WSSV, MBV, HPV hầu hết chỉ tương đồng ứng với mỗi virus WSSV, MBV, HPV. Sự tương đồng với các loài khác là rất thấp, không đáng tin cậy do giá trị E-value đối với các trình tự
khác đều rất cao. Giá trị E-value là một thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự
tương đồng giữa hai trình tự. Giá trị này càng nhỏ hoặc bằng 0 thì sự tương đồng giữa các trình tự càng có ý nghĩa. Điều này chứng tỏ ba cặp mồi do chúng tôi thiết kế có độ chuyên biệt cao về mặt lí thuyết.
Hình 19: Kết quả Blast mồi xuôi của WSSV
Và khi khảo sát trên Annhyb thì chúng tôi nhận thấy các mồi bắt cặp hoàn toàn với các trình tự mục tiêu (với số điểm là 100), và đều cho ra sản phẩm khuếch đại với các kích thước đúng theo lý thuyết, việc bắt cặp ở các vị trí khác nếu có đều có sốđiểm thấp hơn giá trị tin tưởng (dưới 50%).
Hình 20: Kết quả khảo sát trên Annhyb của mồi WSSV
2.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính của mồi bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT. Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT.
Để xác định thành phần GC cũng như nhiệt độ bắt cặp của các mồi chúng tôi dựa vào phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT
(http://www.idtdna.com/analazyer/Applications/OligoAnalyzer/) và có được các
kết quả sau:
Bảng 3: Kết quả kiểm tra cặp mồi của WSSV trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT
WSSV Trình tự Độ dài %GC Tm (0C) Hairpin Self- dimer Hetero- dimer Mồi xuôi 5’-TGTGACCAAGACCATCGAA- 3’ 19 47.4 53.7 1.23 -6.76 -5.5 Mồi ngược 5’-CCACACCTTGAATGTTCCC- 3’ 19 52.6 53.7 0.14 -3.52 -5.5
Bảng 4: Kết quả kiểm tra cặp mồi của MBV trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT
MBV Trình tự Độ dài %GC Tm (0C) Hairpin Self- dimer Hetero- dimer Mồi xuôi 5’- TCCCTGAGATACTATTTA GCAACA - 3’ 24 37.5 53.2 0.33 -3.14 -4.5 Mồi ngược 5’- CTACTAACTGTCGTAGCG ACACC - 3’ 23 52.2 56.6 -2.89 -8.48 -4.5
Bảng 5: Kết quả kiểm tra cặp mồi của HPV trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 trên trang web của IDT
HPV Trình tự Độ dài %GC Tm (0C) Hairpin Self- dimer Hetero- dimer Mồi xuôi 5’- TGTCACCTACAAG AARAGGAGG -3’ 22 47.5 53.8- 54.9 -0.62 -4.67 -6.24 Mồi ngược 5’- TGTCTGAAAATCCT GATGCGT-3’ 21 42.9 54.5 0.8 -3.61 -6.24
Nhận xét:
• Về mặt kích thước, cả ba cặp mồi trên đều đạt yêu cầu về chiều dài cho phép nhân bản tốt nhất của mồi (18 – 25bp).
• Về nhiệt độ biến tính, sự chênh lệch về nhiệt độ biến tính của ba cặp mồi dao động trong giới hạn cho phép, đảm bảo cho sự nhân bản tốt nhất của chúng trong cùng một điều kiện nhiệt độ.
• Về thành phần %GC, 2 cặp mồi WSSV và HPV đều có %GC nằm trong tỉ lệ tốt nhất (40% - 60%), riêng mồi xuôi của MBV có thành phần GC là < 40% nhưng đó chỉ là trên lý thuyết thông qua thực nghiệm chúng tôi sẽđánh giá được chính xác hơn mức độảnh hưởng của yếu tố này đến khả năng nhân bản của mồi. • Cũng trên phần mềm Oligo Analyzer, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự
hình thành cấu trúc thứ cấp của cả ba cặp mồi, và thấy có sự hình thành cấu trúc thứ cấp nhưng ∆G của các cấu trúc thứ cấp luôn ở mức cao hơn -9 kcal/mol( độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
an toàn cho phép của cấu trúc thứ cấp đối với phần mềm khảo sát đặc tính mồi do hãng IDT cung cấp)
Kết luận: Do đó chúng tôi kết luận, về mặt lí thuyết ba cặp mồi được thiết kế cho ba virus của chúng tôi có thể trộn chung trong một phản ứng Multiplex –PCR.
2.4. Kết quả kiểm tra sự bắt cặp của ba cặp mồi trong phản ứng Multiplex –PCR bằng phần mềm của công ty IDT. Multiplex –PCR bằng phần mềm của công ty IDT.
Do phản ứng Multiplex –PCR là phản ứng có sự tham gia đồng thời của nhiều cặp mồi nên việc bắt cặp giữa mồi này và mồi khác cần phải được kiểm soát một cách chặt chẽ. Sau khi phân tích đánh giá từng mồi bằng các công cụ hỗ
trợ trên, các mồi được kiểm tra sự bắt cặp chéo. Mặc dù tất cả đều có sự hình thành cấu trúc thứ cấp nhưng ∆G của các cấu trúc thứ cấp này luôn ở mức cao hơn -9 kcal/mol (độ an toàn cho phép của cấu trúc thứ cấp đối với phần mềm khảo sát đặc tính mồi do hãng IDT cung cấp). Nên chúng tôi có thể kết luận rằng ba cặp mồi chúng tôi thiết kế hoàn toàn có thể tham gia phản ứng Multiplex – PCR một cách hiệu quả với khả năng nhân bản tốt.
Bảng 6: Kết quả sự bắt cặp của ba cặp mồi WSSV, MBV và HPV Hetero-dimer HPVF HPVR WSSVF WSSVR MBVF -4.67 -5.36 -3.3 -5.24 MBVR -4.87 -4.87 -5.19 -3.3 WSSVF -6.21 -5.0 WSSVR -6.43 -3.52
Kết luận: Qua quá trình phân tích các đặc tính của ba cặp mồi về mặt lí thuyết, chúng tôi nhận thấy cả ba cặp mồi có thể dùng cho phản ứng Multiplex – PCR để chẩn đoán đồng thời ba virus gây bệnh đốm trằng (WSSV), còi (MBV), teo gan tụy (HPV).
3. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX –PCR
3.1 Kết quả khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực nghiệm.
Sau khi hoàn tất các phần kiểm tra đặc tính trên lí thuyết, chúng tôi tiến hành khảo sát sự bắt cặp của ba cặp mồi trên chứng dương của ba virus WSSV, MBV và HPV. Do chưa biết được nhiệt độ lai tối ưu cho quy trình nên chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR đơn mồi ở nhiệt độ lai thông thường là 50oC.
Thành phần phản ứng:
12.5 µl Master mix
0.5 µl mỗi mồi
5 µl DNA
Thêm nước Bio –pure cho đủ thể tích 25 µl/phản ứng
Sau khi chạy PCR xong, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 2%, thu nhận kết quả sau:
Hình 21: Kết quảđiện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của ba cặp mồi Chú thích: Giếng 1: WSSV (+) Giếng 2: WSSV (-) Giếng 3: MBV (+) Giếng T: Thang chuẩn 100bp Giếng 4: MBV (-) Giếng 5: HPV (+) Giếng 6: HPV (-) Biện luận kết quả: Dựa vào kết quả điện di trên hình, ở các giếng 2-4-6 không có vạch sản phẩm có kích thước quan tâm. Từđó có thể kết luận quá trình tách chiết và phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm. Ngoài ra chúng tôi nhận thấy 3 vạch mục tiêu (280 bp -447 bp -585 bp) ứng với mỗi virus (WSSV, HPV, MBV) đều xuất hiện khá rõ. Tuy nhiên ở giếng 3, kết quả khuếch đại của cặp mồi MBV ngoài thấy xuất hiện vạch mục tiêu tại vị trí 585bp ra thì chúng tôi còn thấy xuất hiện 1 vạch mờ có kích thước khoảng 210 bp. Nguyên nhân có thể là do nhiệt độ lai thấp làm cho mồi bắt cặp ở những vị trí không đặc hiệu tạo nên băng vạch kí sinh không mong muốn. Mặc dù vậy thông qua kết quả trên ban đầu có thể kết luận cả ba cặp mồi chúng tôi thiết kế đều có khả năng hoạt động tốt. Và sẽ tiến hành khảo sát sự hoạt động của ba mồi đồng thời trong phản ứng Multiplex –PCR, và tìm ra các thông số tối ưu khác.
3.2 Kết quả khảo sát phản ứng Multiplex –PCR tỉ lệ mồi 1:1:1.
Sau khi ba cặp mồi được kiểm tra kĩ lưỡng trên phản ứng PCR đơn mồi thì chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát sự hoạt động của ba cặp mồi khi đưa vào phản ứng Multiplex –PCR với tỉ lệ mồi 1:1:1. Thành phần phản ứng: 12.5 µl Master mix 0.5 µl mồi WSSV 0.5 µl mồi MBV 0.5 µl mồi HPV 3 µl DNA WSSV (+) 3 µl DNA MBV (+) 3 µl DNA HPV (+) Hình 22: Kết quảđiện di khảo sát sự hoạt động và tỉ lệ mồi cho phản ứng Multiplex –PCR với tỉ lệ 1:1:1. Chú thích : Giếng 1: MBV (+) Giếng 2: MBV (-) Giếng 3: HPV (+) Giếng 4: HPV (-) Giếng T: Thang chuẩn 100bp Giếng 5: WSSV (+)
Giếng 6: WSSV (-)
Giếng 7: WSSV –MBV –HPV (+) Giếng 8: WSSV –MBV –HPV (-)
Biện luận kết quả : Dựa vào kết quả của hình kết quả cho thấy rằng ở
các giếng 1, 3, 5 vạch mục tiêu (280 bp, 447 bp, 585 bp) đều xuất hiện với cường
độ sáng rõ. Và kết quả khi chạy trên Multiplex –PCR, chúng tôi nhận thấy ở
giếng 7 cả ba vạch đều đồng thời xuất hiện tại các vị trí khuếch đại tương ứng là 280bp -447 bp -585 bp, với cường độ sáng tương đương với cường độ sáng của các vạch mục tiêu khi chạy trong phản ứng PCR đơn mồi.
Như vậy, chúng tôi có thể kết luận ba cặp mồi có khả năng hoạt động tốt và với tỉ lệ 1: 1:1 khi dùng trong phản ứng Multiplex –PCR là hoàn toàn phù hợp.
3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu
Với tỉ lệ mồi tối ưu trên và dựa trên nhiệt độ biến tính của các mồi (Tm) chúng tôi tiến hành khảo sát lai cho ba cặp mồi trên dãy gradient nhiệt độ từ 50oC – 60oC.
Trong lô thực nghiệm này, chúng tôi khảo sát trên mẫu dương tính (+) với ba virus cần nghiên cứu trong phản ứng Multiplex –PCR.
Hình 23: Kết quảđiện di sản phẩm PCR khảo sát gradient nhiệt độ lai từ 50oC – 60oC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích:
Giếng 1: Nhiệt độ lai 50oC Giếng 2: Nhiệt độ lai 50.7oC
Giếng 3: Nhiệt độ lai 52oC Giếng 4: Nhiệt độ lai 53.7oC Giếng 5: Nhiệt độ lai 56.2oC Giếng 6: Nhiệt độ lai 58.1oC Giếng 7: Nhiệt độ lai 59.3oC Giếng 8: Nhiệt độ lai 60oC Giếng T: Thang chuẩn 100 bp
Biện luận kết quả: Theo như kết quả điện di trên hình cho ta thấy, ở 8 giếng đều thấy xuất hiện ba vạch mục tiêu ứng với các kích thước khuếch đại 280 bp – 447 bp -585 bp nhưng đặc biệt thấy ở giếng 5 ba vạch mục tiêu sáng rõ nhất,
đều nhất. Bên cạnh đó, tất cả các giếng vạch lên rõ ràng không thấy xuất hiện băng kí sinh chứng tỏ quy trình không bị ngoại nhiễm. Như vậy chúng tôi có thể
kết luận tại nhiệt độ 56oC ba cặp mồi sẽ có khả năng nhân bản hiệu quả nhất trong phản ứng Multiplex –PCR.
Kết luận: Trong quy trình của chúng tôi, sau khi yếu tố nhiệt độ lai được tối ưu thấy ba cặp mồi hoạt động tốt ở nhiệt độ lai là ≈ 56.2oC và theo đó chúng tôi tiến hành khảo sát các bước tiếp theo ở nhiệt độ lai là 56oC.
3.4 Kết quả khảo sát độđặc hiệu của ba cặp mồi
Với tỷ lệ mồi và nhiệt độ lai tối ưu như trên, chúng tôi tiến hành đặt phản
ứng PCR khảo sát độ đặc hiệu của ba cặp mồi trên các tác nhân virus gây bệnh trên tôm khác. Mồi có độđặc hiệu cao là mồi chỉ bắt cặp với trình tự WSSV hoặc MBV hoặc HPV mà không bắt cặp với các virus khác. Và sản phẩm khuếch đại
đặc trưng là các đoạn DNA có kích thước nhưđã nghiên cứu, sau quá trình điện di được so với thang DNA chuẩn.
Thành phần phản ứng PCR:
12.5 µl Master mix
0.5 µl mồi WSSV 0.5 µl mồi MBV 0.5 µl mồi HPV
Chú ý: Lượng DNA đưa vào mix 5 µl DNA của IHHNV; 2.5 µl cDNA của TSV, YHV, GAV.
Thêm nước cất hai lần cho đủ 25 µl
Hình 24: Kết quảđiện di khảo sát độđặc hiệu của phản ứng Chú thích Giếng 1: IHHNV(+) với cặp mồi IHHNV(318 bp) Giếng 2: IHHNV với ba cặp mồi WSSV -MBV -HPV Giếng 3: TSV(+) với cặp mồi TSV(230 bp) Giếng 4: TSV với ba cặp mồi WSSV -MBV –HPV Giếng T: Thang 100 bp Giếng 5: YHV(+) với cặp mồi YHV(180 bp) Giếng 6: YHV với ba cặp mồi WSSV -MBV –HPV Giếng 7: GAV(+) với cặp mồi GAV(456 bp) Giếng 8: GAV với ba cặp mồi WSSV -MBV -HPV Giếng 9: WSSV –MBV –HPV (+) Giếng 10: Chứng âm (-) Kết quả và biện luận: Theo hình, chúng tôi nhận thấy ở giếng 9 ba vạch mục tiêu hiện sáng rõ điều đó có nghĩa là ba cặp mồi của chúng tôi có khả năng nhân bản tốt đúng trình tự mục tiêu, còn ở các giếng 1-3-5-7 thấy xuất hiện các vạch sáng đúng với vị trí bắt cặp của 4 mồi IHHNV, TSV, YHV và GAV điều đó có nghĩa là 4 chứng dương chúng tôi chọn có khả năng sử dụng tốt phù hợp cho việc khảo sát độđặc hiệu của ba cặp mồi chúng tôi thiết kế. Và điều quan trọng
khi nhìn trên hình điện di chúng tôi nhận thấy ở các giếng 2-4-6-8 cho kết quả
âm tính với ba cặp mồi WSSV –MBV –HPV. Như vậy chúng tôi có thể kết luận rằng ba cặp mồi chúng tôi thiết kế có khả năng nhân bản hiệu quả và đặc hiệu với trình tự mục tiêu WSSV, MBV, HPV mà không bắt cặp với các trình tự của các virus khác trên tôm.
Kết luận: Dựa vào kết quả trên chúng tôi thấy ba cặp mồi chúng tôi sử
dụng cho quy trình là hoàn toàn đặc hiệu với các trình tự mục tiêu, có hiệu quả
nhân bản cao.
3.5 Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình
Để tiến hành khảo sát độ nhạy của quy trình chúng tôi sử dụng nồng độ
DNA trong bản mẫu là 5 x 108 copies/ml. Tiến hành pha loãng mẫu theo bậc 10 và cho chạy phản ứng PCR cho từng nồng độ. Hình 25: Kết quảđiện di sản phẩm PCR với mẫu pha ở các nồng độ khác nhau Chú thích: Giếng 1: Nồng độ 5 x 108 copies/ml Giếng 2: Nồng độ 5 x 107 copies/ml Giếng 3: Nồng độ 5 x 106 copies/ml Giếng 4: Nồng độ 5 x 105 copies/ml Giếng 5: Nồng độ 5 x 104 copies/ml Giếng 6: Nồng độ 5 x 103 copies/ml