Phương pháp xứ lý và bảo quản mẫu

3. PHƯƠNG PHÁP

3.1. Phương pháp xứ lý và bảo quản mẫu

Loại mẫu : tôm nhỏ, mô cơ, chân bơi, gan và mang. mẫu tươi là tốt nhất. Kiểm tra WSSV : tốt nhất là mang

Kiểm tra MBV : tốt nhất là gan

Kiểm tra HPV : tôt nhất là gan hoặc tụy

Lượng mẫu : khoảng 100 -200mg hoặc 30 -50 con tôm postlarvae.

™ Mẫu tôm Postlarvae: lấy mẫu nguyên con khoảng 100 - 150 con còn sống (là tốt nhất) hoặc cốđịnh trong cồn 950. Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng là 10 -15 cá thể

™ Mẫu tôm giống: lấy toàn bộ phần đầu của tôm bỏ mắt (có cả các cơ

quan bên trong), số lượng khoảng 100 - 150 con, tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hay đã được cốđịnh trong cồn 950.

™ Mẫu tôm nuôi thương phẩm: lấy một phần nhỏ cơ quan đích cho mỗi virus của 10 - 20 con có biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 95oC.

™ Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên lấy mẫu mắt, chân bơi 2 hoặc một phần mang, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 95oC. Lượng mẫu không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam

Dùng kẹp có bề mặt trơn để lấy mẫu, rửa cồn và đốt thật kỹ sau khi lấy cho mỗi mẫu

Bảo quản mẫu: ở nhiệt độ -20oC hoặc trong cồn tuyệt đối ở 4oC kể từ

3.1.2 . Phương pháp tiền xử lý và bảo quản mẫu

3.1.2.1. Hóa chất dùng cho xử lý mẫu (bảo quản tối, nhiệt độ 2 -8oC)

ƒDung dịch TE 1X : 30ml

3.1.2.2 Tiến hành xử lý mẫu

™ Đánh dấu các tube 1.5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu.

™ Tùy loại mẫu, cho lượng mẫu tương đương thể tích 200 - 300μl vào một tube vô trùng có sẵn 200μl dung dịch TE 1X, dùng chày nghiền thật nát, cho tiếp vào 300μl dung dịch TE 1X, vortex 30s.

™ Dùng 200μl mẫu đã xử lý để tách chiết acid nucleic. Nếu chưa tách ngay thì phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC ( sau đó trước khi dùng phải trộn

đều trước khi tách chiết)

¾ Sau khi tiến hành xong các bước phải cất dung dịch TE 1X ngay rồi mới thực hiện các bước tiếp theo trên mẫu.

3.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA

3.2.1 Nguyên tắc

Tách chiết DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dung các tác nhân biến tính mạnh để

phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein, màng tế bào,…). DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ởđiều kiện lạnh và thu lại cặn qua các lần ly tâm. Cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -200C.

3.2.2 Các bước tiến hành

¾ Đánh dấu các tube 1.5ml vô trùng bằng kí hiệu mẫu

¾ Cho 200µl mẫu bệnh đã chuẩn bị ở trên vào trong tube 1.5ml vô trùng

đã chứa sẵn 900µl dung dịch Trirol, vortex 30s sau đó để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch Chloroform, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube có màu trắng đục. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.

¾ Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào tube vô trùng có sẵn 600µl dung dịch Isopropanol có thêm chất trợ tủa. Trộn đều để yên 10 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.

¾ Loại bỏ dịch nổi thu cặn màu xanh (hoặc hồng). Cho từ từ 900µl dung dịch Ethanol 70% vào. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút.

¾ Loại bỏ dịch nổi thu cặn. Đê khô ở 60oC trong 10 – 15 phút. Cho vào 50µl dung dịch TE 1X. Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn.

™ Bảo quản mẫu DNA ở -20oC đến khi tiến hành PCR

3.2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MỒI TRÊN LÍ THUYẾT

Trong phương pháp PCR đặc biệt là phản ứng Multiplex –PCR, mồi là chỉ

tiêu quan trọng nhất đểđạt được sự khuếch đại đặc trưng và có tính hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn mang tính quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại. - Bắt cặp đặc hiệu với ít nhất 70% chiều dài mồi.

- 5 nucleotide đầu tiên của mồi bắt cặp hoàn toàn với trình tự nucleotide mục tiêu.

- Thành phần GC lý tưởng của đoạn mồi nằm trong khoảng 40 – 60% để

nhiệt độ bắt cặp của mồi là không quá thấp.

- Tránh lặp lại các cặp GC nhiều lần, dễ tạo ra các khuếch đại ký sinh do bắt cặp với các trình tự khác, dẫn đến việc tổng hợp không chính xác.

- Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.

- Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự

chênh lệch nhiệt độ lớn thì mồi có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn mồi có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.

- Trình tự của được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, cũng như không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự tái bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi.

- Thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không nên có hơn hai G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.

- Trình tự nằm giữa 2 mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.

Bằng các phần mềm Oligo Analyze 3.0, Annhyb 4.939, ClustalX và Blast trên NCBI cùng các trình tự genome WSSV, MBV, HPV được tải về từ Gene bank, các cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lí thuyết nhằm đảm bảo các yêu cầu về

kích thước, %GC, nhiệt độ biến tính, các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp, các dimer), khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.

™ Lưu ý: Một yêu cầu quan trọng của mồi là nó phải khuếch đại đúng trình tự mục tiêu cần quan tâm. Ngoài trình tự mục tiêu của loài đang khảo sát, mồi không được bắt cặp lên các trình tự của loài khác. Do đó việc xác định khả

năng nhân bản chọn lọc của mồi luôn luôn được đòi hỏi. Việc xác định này phải

được thực hiện trên cả lý thuyết và thực nghiệm.

3.3PHƯƠNG PHÁP PCR

Về mặt thực nghiệm, phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn :

o Giai đoạn biến tính (deneturation).

o Giai đoạn lai (hybridization) hay còn gọi là giai đoạn bắt cặp mồi (primer annealing)

o Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation) mạch DNA mới nhờ sự

hoạt động của DNA polymerase.

Trong thực tế một phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ vì sau 40 chu kỳ hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do các nguyên nhân:

Sự phân hủy và cạn kiệt dần các thành phần của phản ứng Sự xuất hiện các sản phẩm phụức chế phản ứng

Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.

3.3.1 Thành phần phản ứng PCR

ƒ Master mix ( Enzyme Tag polymerase 1 đơn vị, dATP, dTTP, dGTP, dCTP, MgCl2 và dung dịch đệm) (Promega)

ƒ Nước Bio –pure

ƒ Mồi

ƒ DNA mạch khuôn

3.3.2 Cách tiến hành

Chuẩn bị các tube 0.2ml có chứa sẵn thành phần cho một phản ứng PCR.

Đặt chương trình cho máy luân nhiệt hoạt động:

™ Bước 1: 1 chu kỳ 95 oC 15 phút

™ Bước 2: 40 chu kỳ 95 oC 30 giây 50 oC 30 giây 72 oC 30 giây

™ Bước 3: 1 chu kỳ 72 oC 6 phút

¾ Sản phẩm PCR được mang đi điện di trên gel agarose 2%, nếu chưa

điện di thì lưu giữ sản phẩm trong điều kiện – 20oC

3.4PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN GI TRÊN GEL AGAROSE

3.4.1Nguyên tắc

Nguyên tắc của phản ứng điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên chịu tác

động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỷ số điện tích/ khối lượng, nhờđó các thành phần khác nhau sẽ được tách ra thành những vết riêng và được phát hiện bằng nhiều cách khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các phân tử DNA đều có hình dạng và tỷ sốđiện tích/khối lượng như nhau do đó không tách được bằng

điện di thông thường mà phải dùng kỹ thuật điện di trên gel. Gel được làm bằng Agarose hay Polyacrylamid có các lỗ do các dây polymer Agarose hay Polyacrylamid đan xen với nhau tạo thành khi điện di. Phân tử DNA phải chui qua các lỗ này để đến điện cực, do đó những phân tử DNA nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử lớn hơn, nhờ đó mà ta tách được các DNA theo kích thước phân tử mong muốn.

™ Kết quảđược đọc bằng nhiều cách khác nhau như là dùng các chất nhuộm gắn xen vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide hoặc SYBR GREEN …)

Chú ý: Ethidium bromide là một hóa chất cực độc có khả năng gây đột biến.

3.4.2. Tiến hành

Chuẩn bị gel có số giếng bằng với số mẫu, thêm một giếng cho thang chuẩn.

¾ Cho vào mỗi giếng trên plate nạp mẫu 3μl dung dịch nạp mẫu + 7μl sản phẩm PCR của mỗi mẫu rồi chuyển lên từng giếng trên gel. Điện di ở 50 vol trong 5- 10 phút, sau đó tăng lên 80 vol trong vòng 25 -30 phút. Ngâm gel trong dung dịch Ethidium bromide 15 phút.

¾ Chuyển gel lên bàn đèn tử ngoại quan sát, chụp hình, ghi nhận kết quả

so với thang chuẩn.

3.5PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ LAI TỐI ƯU CỦA MỒI

ƒ Nguyên tắc: Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng PCR mà đặc biệt là Multiplex -PCR. Nhiệt độ lai quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả nhân bản của phản ứng:

¾Nếu nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của cặp mồi sử dụng dễ tạo ra các sản phẩm ký sinh không mong muốn.

¾Nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi vào DNA bản mẫu, do đó hiệu quả của nhân bản sẽ không cao.

Từ nhiệt độ biến tính của các mồi được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt

độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai được tính theo công thức: Ta = (Tm primerF + Tm primerR)/2 ± 50C

ƒ Tiến hành: Để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho các cặp mồi trên một gradient nhiệt độ từ 500C đến 600C. Trừ sự

thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác (DNA bản mẫu, mồi) và các điều kiện khác ( điều kiện về thiết bị, thời gian phản ứng…) của phản ứng đều được giữ nguyên và đồng nhất. Sau đó tiến hành điện di phân tích kết quả để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu nhất chung cho cả quy trình.

3.6 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘĐẶC HIỆU CỦA MỒI

3.6.1. Phương pháp xác định độđặc hiệu của mồi trên lí thuyết

Nhằm xác định độ đặc hiệu của các mồi trên cơ sở lý thuyết chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi lên trình tự mục tiêu thông qua chương trình Annhyb 4.939, sắp gióng cột từng mồi với các trình tự gen của ba virus nghiên cứu tải về từ Gene Bank bằng phần mềm ClustalX, cũng như tiến hành BLAST trình tự mồi lên NCBI để tìm kiếm những chủng có trình tự tương

đồng với trình tự này.

3.6.2. Phương pháp xác định độđặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm

ƒ Nguyên tắc: Độ đặc hiệu được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng gắn Primer nhầm (Mis –priming) trên tổng số lần gắn primer tức là sự lai giữa primer và khuôn mẫu tại vị trí đích của nó. Mồi có độđặc hiệu cao là mồi chỉ bắt cặp với trình tự WSSV hoặc MBV hoặc HPV mà không bắt cặp với các virus khác. Và sản phẩm khuếch đại đặc trưng là các đoạn DNA có kích thước nhưđã nghiên cứu, sau quá trình điện di được so với thang DNA chuẩn.

ƒ Tiến hành: Tiến hành đặt phản ứng PCR với chứng dương (hoặc các mẫu đã biết trước dương tính với bệnh) của WSSV, MBV, HPV và các bệnh trên tôm do các virus khác gây ra, để kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi với trình tự

virus cần quan tâm. Tiến hành điện di phân tích kết quả.

3.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA QUY TRÌNH

ƒ Nguyên tắc: Độ nhạy là một yếu tố quyết định giá trị của một phương pháp chẩn đoán. Nó cho biết giới hạn số lượng bản mẫu DNA nhỏ nhất mà một phương pháp có thể phát hiện. Ðộ nhạy của phương pháp được kiểm tra dựa trên cơ sở pha loãng mẫu tách chiết DNA của virus.

ƒ Tiến hành: Trong phương pháp này, để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mẫu ban đầu là 5x108 copies/ml thànhnhiều nồng độ khác và tiến hành đặt phản ứng PCR cho từng nồng độ. Điện di phân tích kết quả.

PHẦN III

1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI

Để tiến hành nghiên cứu về việc đưa ra phương pháp chẩn đoán đồng thời ba virus: gây bệnh đốm trắng (WSSV –White spot syndrome virus), bệnh còi (MBV –Monodon Baculovirus), bệnh teo gan tụy (HPV –hepatopancreatic virus) trên thủy sản, chúng tôi đã thiết kế ba cặp mồi đặc hiệu cho ba virus. Đầu tiên chúng tôi tiến hành download các trình tự gen của WSSV, HPV trên NCBI, sử

dụng chương trình ClustalX để tìm vùng bảo tồn cao nhất. Riêng MBV do bộ gen chưa được giải mã hoàn chỉnh theo đó chúng tôi sử dụng đoạn gen được nghiên cứu nhiều nhất để thiết kế mồi cho MBV. Khi đã tìm được cặp mồi thỏa mãn

điều kiện nằm trong vùng bảo tồn cao nhất cao, chúng tôi dùng chương trình Annhyb để kiểm tra sự bắt cặp của mồi trên vùng trình tự đích, và cuối cùng quyết định sử dụng ba cặp mồi sau: Bảng 2: Ba cặp mồi được thiết kế Primer Trình tự Độ dài Kích thước sản phẩm PCR(bp) WSSV F 5’ –TGTGACCAAGACCATCGAA- 3’ 19 280 WSSV R 5’ –CCACACCTTGAATGTTCCC- 3’ 19 280 MBV F 5’ –TCCCTGAGATACTATTTAGCAACA-3’ 24 585 MBV R 5’ –CTACTAACTGTCGTAGCGACACC- 3’ 23 585 HPV F 5’ –GTCACCTACAAGAARAGGAGG - 3’ 22 447 HPV R 5’ –TGTCTGAAAATCCTGATGCGT- 3’ 21 447 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI TRÊN LÍ THUYẾT

2.1Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các trình tự bằng ClustalX và BioEdit và BioEdit

Chúng tôi sử dụng phần mềm ClustalX và BioEdit nhằm thiết kế ba cặp mồi hoàn toàn đặc hiệu cho DNA của WSSV, MBV và HPV dựa trên việc sắp

gióng và tìm vùng bảo tồn cao nhất của các trình tự đựơc download về từ trang web NCBI.

Hình 17: ClustalX cặp mồi MBV

Theo như hình 16, 17, 18 và 19, hai cặp mồi của WSSV và MBV bắt cặp hoàn toàn với trình tự mục tiêu. Tuy nhiên đối với cặp mồi của HPV chúng tôi thấy, mồi ngược bắt cặp hoàn toàn nhưng trên mồi xuôi có 1 vị trí không thể bắt cặp giữa mồi và trình tự DNA. Dù vậy nhưng do điểm này nằm giữa đoạn mồi nên chúng tôi đã sử dụng một nu thay thế (R). Các nu thay thế này giúp mồi bắt cặp chuyên biệt hơn với trình tự mục tiêu. Hiệu quảđặc hiệu của các cặp mồi sẽ được đánh giá chính xác hơn trong quy trình thực nghiệm.

Hình 18: ClustalX cặp mồi HPV

2.2 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu và khả năng nhân bản chọn lọc của mồi trên lý thuyết

Kết quả khảo sát trên Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) cho thấy mỗi cặp mồi được thiết kế cho mỗi loại virus WSSV, MBV, HPV hầu hết chỉ tương đồng ứng với mỗi virus WSSV, MBV, HPV. Sự tương đồng với các loài khác là rất thấp, không đáng tin cậy do giá trị E-value đối với các trình tự

khác đều rất cao. Giá trị E-value là một thông số thể hiện mức độ tin cậy về sự