Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu

Phế liệu được thu mua từ xí nghiệp Nha Trang Seafood (F17) thuộc thành phố Nha Trang tỉnh Khánh Hòa. Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi được thu mua được bỏ trong thùng xốp có ướp đá xung quanh để giữ độ tươi cho nguyên liệu và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm.

Sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm, nguyên liệu được chia thành 4 lô, mỗi lô được chia thành các bọc nhỏ, khối lượng mỗi bọc là 400g.

Cách xử lý từng lô nguyên liệu:

+Lô 1: được đem đi sản xuất ngay thành chitin (phế liệu sau khi được tách tôm thịt, chưa qua bảo quản, thời gian nhỏ hơn 2 tiếng).

+Lô 2: bảo quản ở nhiệt độ phòng: phế liệu tôm sau khi được vận chuyển về được bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 30320C) trong thùng nhựa, sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau thì được đem đi sản xuất chitin.

+Lô 3: bảo quản ở nhiệt độ lạnh (570C): phế liệu tôm sau khi được vận chuyển về được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (từ 570C) trong tủ lạnh, sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau thì được đem đi sản xuất chitin.

+Lô 4: phơi khô: phế liệu được vận chuyển từ nhà máy về được đem đi phơi khô làm giảm độ ẩm xuống thấp, hạn chế sự hoạt động của vi sinh vật nhằm kéo dài thời gian bảo quản, sau đó bảo quản ở nhiệt độ thường trong thời gian một tháng sau đó mới đem đi sản xuất chitin.

2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Phơi khô

Bảo quản lạnh Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Xác định thành phần hóa học Rửa sạch Khử khoáng Khử protein Rửa sạch Chitin 24h 48h 72h 24h 48h 72h pH protein Acid amin NH3 Độ ẩm Khoáng Protein Độ ẩm Khoáng Độ deacetyl Cảm quan

Xác định các chỉ tiêu của chitin

Đề xuất biện pháp bảo quản phế liệu Đánh giá chất lượng và so sánh HCl 4% T0 thường =12h, w/v=1/5 NaOH 4% T0 thường =24h, w/v=1/5 Lipit Mật độ khối KNTN với nước KNHP chất màu Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.2.2.2. Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu sau khi được thu mua ở F17 về được chia làm 4 lô, nhặt sạch rác bẩn, 1 lô mang đi phơi khô để giảm độ ẩm, 2 lô được mang đi bảo quản ở điều kiện thường và điều kiện lạnh trong các khoảng thời gian khác nhau: 24h, 48h, 72h, lô còn lại được mang đi khử khoáng ngay. Mẫu ở mỗi lô được mang đi phân tích để xác định thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu, gồm các chỉ tiêu: hàm lượng protein, acid amin, NH3, pH, ẩm, khoáng, lipit. Các lô nguyên liệu sau khi đạt các thời gian bảo quản khác nhau cũng được mang đi sản xuất chitin với công đoạn đầu tiên là khử khoáng.

Nguyên liệu được khử khoáng bằng acid HCl 4%, ở điều kiện nhiệt độ thường, trong thời gian 12 tiếng, với tỷ lệ w/v=1/5. Trong thời gian khử khoáng phải liên tục khuấy đảo. Sau thời gian khử khoáng, mẫu được đem đi rửa trung tính.

Sau đó, mẫu được khử protein bằng NaOH 4%, ở điều kiện nhiệt độ thường, trong thời gian 24 tiếng, với tỷ lệ w/v=1/5. Sau đó mẫu được đem rửa trung tính và đem phơi khô ta thu được chitin.

Chitin thu được mang đi kiểm tra các chỉ tiêu: cảm quan, độ ẩm, khoáng, protein, độ deacetyl, mật độ khối, khả năng trương nở với nước và khả năng hấp phụ chất màu để xác định chất lượng của chitin.

So sánh chất lượng của các loại chitin thu được khi bảo quản nguyên liệu ban đầu ở các điều kiện khác nhau. Từ đó đề xuất các biện pháp bảo quản phế liệu ban đầu phù hợp.

2.2.3. Các phương pháp phân tích

2.2.3.1. Xác định màu sắc, độ mềm mại của chitin (Phụ lục [1])

2.2.3.2. Kiểm tra hàm lượng ẩm và hàm lượng tro (AOAC, 1990) (Phụ lục [1])2.2.3.3. Đo pH 2.2.3.3. Đo pH

Cân khoảng 1g nguyên liệu, nghiền nhỏ, dùng 100ml nước cất để lọc dịch, dùng dịch lọc đó mang đi đo pH.

2.2.3.4. Xác định protein trong nguyên liệu bằng phương pháp biuret

- Pha thuốc thử biuret: hòa tan 1,5g CuSO4.5H2O và 6g C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất. Đựng dung dịch trong chai màu.

- Xây dựng đường chuẩn: pha dung dịch gốc BSA thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 mg/ml. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch gốc BSA với nồng độ tương ứng như trên, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 4ml thuốc thử Biuret, ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút, sau đó đo ở bước sóng 570nm.

Từ các số liệu thu được, lập phương trình đường chuẩn để từ đó tính toán hàm lượng protein trong mẫu.

- Xử lý mẫu: ngâm 35g mẫu khô hoặc 310g mẫu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 hoặc 1:15w/v. Sau đó đem ủ ở 950C/6h. Sau khi ủ, tiến hành lọc khối ủ bằng thiết bị lọc chân không để thu dịch lọc và định mức đến 1 thể tích nhất định (V1). Lấy khoảng 10ml dịch lọc đem đi lọc bằng giấy lọc Whatman Filter paper. Lấy 1ml dịch sau khi lọc lần 2 bổ sung thêm 4ml dung dịch thuốc thử Biuret, ủ ở 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, tiến hành đo độ hấp thụ quang học của dung dịch ở bước sóng 570nm.

- Tính kết quả

Hàm lượng protein của mẫu được xác định theo công thức sau

Trong đó:

V1: thể tích dịch lọc (ml)

C: Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn biuret (mg/ml) W: khối lượng mẫu ủ (g)

MC: độ ẩm của mẫu (%)

w (g) x (100- MC)/100 x 1000 V1 (ml) x C (mg/ml) x 100 %Protein( dry basis) =

2.2.3.5. Xác định hàm lượng NH3 theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Dùng một chất kiềm mạnh hơn NH3 để đẩy NH3 ra khỏi nguyên liệu nhưng chất kiềm này không được quá mạnh, sau đó dùng thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước lôi cuốn NH3 cho ngưng tụ vào trong cốc hứng có chứa dung dịch H2SO4 tiêu chuẩn rồi định lượng phần axit tiêu chuẩn dư bằng dung dịch NaOH tiêu chuẩn.

2.2.3.6. Xác định hàm lượng đạm acid amin bằng phương pháp formol

Các acid amin có tính chất lưỡng tính vì vậy khi cho formol vào dung dịch có chứa acid amin formol sẽ khóa nhóm amin (- NH2) do đó tính axit của acid amin trội hơn, khi đó ta sẽ dùng 1 chất kiềm để định lượng acid hình thành, từ lượng kiềm tiêu tốn xác định được hàm lượng nitơ acid amin.

2.2.3.7. Xác định hàm lượng lipit theo phương pháp Folch

- Tách lipit từ mẫu:

+Cân 1g mẫu đã được trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20ml. +Cho thêm 600l nước cất, 5ml Methanol, 10ml Chloroform và 200l BHT. Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút.

+Đồng hoá mẫu bằng máy trong 1 phút.

+Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn.

+Cho thêm 5ml Methanol và 10ml Chloroform vào vial và đồng hoá mẫu trong 20 giây

+Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn.

+Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100ml.

+Cho thêm 7,5ml NaCl 0.9% vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 50C trong khoảng 4giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.

+Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipit hoà tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hoá hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein….).

+Xác định thể tích chiết ở trên (Vdm).

+Cho thêm 5ml CH3OH 50% vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100ml. Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần.

+Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 50C. - Định lượng lipit

+Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100ml.

+Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 370C đến khi còn lại thể tích khoảng 1ml.

+Hoà tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ Chloroform. +Chuyển nhượng mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng Chloroform vừa đủ 5ml.

+Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipit tổng. - Xác định hàm lượng lipit tổng

+Lấy chính xác 2ml (Vm) dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4ml đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi.

+Làm khô bằng khí nitơ.

+Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 6570 psi trong một giờ.

- Tính kết quả

Lipit tổng số (%) tính theo công thức:

% Xk (g/g) = *100 * * * ) ( 1 0 Vm T m Vdm m m  Trong đó:

Xk: Hàm lượng lipit tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g).

m: Trọng lượng cân mẫu (g).

Vđm: Thể tích định mức sau xử lý (ml) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm của mẫu (%)

2.2.3.8. Xác định protein trong sản phẩm bằng phương pháp Microbiuret

- Pha thuốc thử Microbiuret: lấy 173g sodium citrate và 100g sodium carbonat, đem hòa tan trong 500ml nước nóng nhưng không để nước sôi. Lấy 17,3g CuSO4 hòa tan trong 100ml nước cất và thêm vào hỗn hợp trên. Sau đó thêm nước cất vào cho đủ 1000ml. Dung dịch được đựng trong chai màu.

- Xây dựng đường chuẩn: pha dung dịch BSA thành các nồng độ 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 mg/ml. Cho vào mỗi ống nghiệm 4ml dung dịch BSA chuẩn, sau đó thêm 200l thuốc thử microbiuret, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15phút, sau đó đo uv ở bước sóng 330nm.

Từ các số liệu thu được, lập phương trình đường chuẩn để tính toán lượng protein trong mẫu.

- Xử lý mẫu: lấy 1g mẫu + 10ml NaOH 3%, đem ủ ở 800C/8h. Sau đó hỗn hợp này được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, rồi sau đó mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 1015ml NaOH 3% để rửa bã. Định mức dịch lọc đến 1 thể tích nhất định V1. Sau đó đem dịch đi li tâm ở 5000 vòng/15 phút.

- Sử dụng 4ml dịch sau li tâm, sau đó thêm 200l thuốc thử microbiuret, ủ trong 15phút ở nhiệt độ phòng và đo ở bước sóng 330nm

Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy ra hàm lượng protein trong mẫu.

- Tính kết quả:

Hàm lượng protein của mẫu chitin được xác định theo công thức sau

w (g) x (100- MC)/100 x 1000 mg/g V1 (ml) x C (mg/ml) x 100 % Protein (dry basis) =

Trong đó:

V1: thể tích dịch lọc (ml)

C: Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn microbiuret (mg/ml) W: khối lượng mẫu ủ (g)

MC: độ ẩm của mẫu (%)

2.2.3.9. Xác định độ deacetyl của chitin

- Xây dựng đường chuẩn N- acetyl glucosamine

+Hòa tan 0.1105g N- acetyl glucosamine trong 10ml H3PO4 được dung dịch có nồng độ 0,05M

+Lấy 2ml dung dịch trên sau đó thêm 98ml nước cất được dung dịch có nồng độ 0,001M

+Từ dung dịch trên ta pha thành các dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,0001; 0,0002; 0,0004; 0,0006; 0,0008; 0,001M

+Sau kh đã có dãy nồng độ như trên, tiến hành đo OD ở bước sóng 210nm để xây dựng đường chuẩn N- acetyl glucosamine

- Chuẩn bị mẫu

+Hòa tan 100mg chitin trong 20ml H3PO4 85% khuấy đảo ở 600C trong vòng 40 phút.

+Lấy 6ml dung dịch ở trên định mức đến 100ml bằng nước cất, sau đó ủ dung dịch trên trong 2 giờ ở 600C.

+Sau khi ủ, dung dịch trên được đo OD ở bước sóng 210nm.

+Từ kết quả đo được, thay vào đường chuẩn N- acetyl glucosamine để tính ra lượng N- acetyl glucosamine.

- Tính kết quả

Độ deacetyl của chitin được tính theo công thức

) 1 ( 100 molGlc molGlcNAC molGlcNAC DD        16117 , 0 ) 20321 , 0 (    w molGlcNAC molGlc  

Trong đó:

w: khối lượng mẫu khô tuyệt đối

molGlcNAC: hàm lượng N- acetyl glucosamine xác định theo đường chuẩn molGlc: hàm lượng glucosamine

2.2.3.10. Xác định mật độ khối của chitin

Mẫu chitin được nghiền nhỏ đến kích thước 80100 mesh (0,149mm). Cân 1g mẫu chitin (khô, đã biết độ ẩm) cho vào ống ly tâm có định mức thể tích bằng 15ml, lắc trên vortex 1 phút, gõ nhẹ ống trên mặt bàn 10 lần, sau đó ghi lại thể tích của mẫu.

2.2.3.11. Xác định khả năng trương nở với nước của chitin

Mẫu chitin được nghiền nhỏ đến kích thước 80100 mesh (0,149mm). Cân 0,5g chitin (khô, đã biết độ ẩm) cho vào ống ly tâm có định mức thể tích bằng 15ml, thêm vào 10ml nước, trộn đều hỗn hợp trong 2 phút, để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 45 phút. Gạn bỏ thật kỹ phần dịch, cân ống lại.

Khả năng trương nở với nước được xác định theo công thức KNTN (%) = nước ngấm vào mẫu (g) *100

khối lượng mẫu (g)

2.2.3.12. Khả năng hấp phụ chất màu của chitin

- Xây dựng đường chuẩn

+Cân 0,0025g chất màu crystal violet hòa tan trong 1000ml nước cất thu được dung dịch có nồng độ 2,5mg/l.

+Từ nồng độ trên pha thành các dung dịch có nồng độ 0,25mg/ml; 0,5mg/ml; 1mg/ml; 1,5mg/ml; 2mg/ml.

+Sau khi đã có dãy nồng độ như trên, tiến hành đo ở bước sóng 590nm để xây dựng đường chuẩn.

+Cân 0,1g mẫu và 50ml dung dịch chất màu (nồng độ 2,5mg/ml), cho hỗn hợp vào bình tam giác 125ml, lắc hỗn hợp với tốc độ 150 vòng/phút trong khoảng 1 giờ ở 250C

- Tính kết quả: Lượng chất màu hấp phụ vào chitin được xác định bằng cách tính sự khác nhau về nồng độ của dung dịch thuốc nhuộm đầu tiên và sau dung dịch sau khi lọc, tính theo %.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý trên phần mềm excel 2003. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy trung bình cộng của 3 lần thí nghiêm.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Biến đổi chất lượng của phế liệu tôm

Phế liệu sau khi được thu mua tại công ty F17 thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa được xử lý và bảo quản ở các chế độ khác nhau. Tùy theo từng điều kiện bảo quản mà chất lượng phế liệu biến đổi được thể hiện qua các chỉ tiêu về: hàm lượng khoáng (Hình 3.1), protein (Hình 3.2), lipit (Hình 3.3), amoniac và acid amin (Hình 3.4), pH (Hình 3.5). 0 5 10 15 20 25 30 35 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Mẫu nguyên liệu

H à m l ư ợ n g k h o á n g ( % )

Hình 3.1 Hàm lượng khoáng từ các mẫu phế liệu có chế độ bảo quản khác nhau

M1: đầu vỏ tôm tươi, bảo quản ở nhiệt độ thường <2h; M2: đầu vỏ tôm, bảo quản 24h ở

nhiệt độ thường; M3: đầu vỏ tôm, bảo quản 48h ở nhiệt độ thường; M4: đầu vỏ tôm, bảo quản 72h ở nhiệt độ thường; M5: đầu vỏ tôm, bảo quản 24h ở nhiệt độ lạnh (570C); M6: đầu vỏ tôm, bảo

quản 48h ở nhiệt độ lạnh (570C); M7: đầu vỏ tôm, bảo quản 72h ở nhiệt độ lạnh (570C); M8:

0 10 20 30 40 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Mẫu nguyên liệu

H à m l ư ợ n g p ro te in ( % )

Hình 3.2 Hàm lượng protein từ các mẫu phế liệu có chế độ bảo quản khác nhau

0 1 2 3 4 5 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Mẫu nguyên liệu

H à m l ư ợ n g l ip it ( % )

Hình 3.3 Hàm lượng lipit từ các mẫu phế liệu có chế độ bảo quản khác nhau

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Mẫu nguyên liệu

H à m l ư ợ n g ( % ) HL amoniac (%) HL acid amin (%)

Hình 3.4 Hàm lượng amoniac, acid amin từ các mẫu phế liệu có chế độ bảo quản khác nhau

6 6,5 7 7,5 8 8,5 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8