Dịch chiết tươi được chiết trực tiếp từ cây bìm bìm

3.4. Khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tan trong dịch chiết thân cây bìm bìm

3.4.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết

3.4.1.1. Chuẩn bị dịch kháng khuẩn

Chuẩn bị dịch chiết tươi từ cây bìm bìm sau đó được bảo trong bình tối màu và bỏ vào tủ lạnh để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo.

Lấy 200 ml dịch chiết đã chuẩn bị ở mục 3.3 tiến hành cô đặc ở 500C trên máy cơ quay, sau đó lọc loại bỏ các chất keo chúng tôi thu nhận được khoảng 30 ml dịch cơ đặc có nồng độ 60 mg/ml.

Dịch chiết tươi và dịch cô đặc được bảo quản lạnh để nghiên cứu tiếp theo.

3.4.1.2. Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định

Theo một số tài liệu nghiên cứu về các thành phần chủ yếu trong dịch chiết của thực vật chứa polyphenols, flavonoids, saponins, ankalnoid có khả năng kháng nhiều loại vi sinh vật Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Với một lượng nhỏ dịch chiết

từ cây bìm bìm có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển một cách có chọn lọc một số chủng vi sinh vật. Trong phạm vi của nghiên cứu này chỉ xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tươi và dịch chiết thân qua quá trình xử lý theo sơ đồ quy trinh tách chiết tại phần II (mục 2.2.1.1) đối với 2 loại vi sinh vật để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn là: Bacillus subtilis và Bacillus cereus.

Hai chủng vi sinh vật kiểm định từ ống gốc được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (phụ luc 1) trong thời gian 18 giờ ở nhiệt độ 370C để thu nhận canh khuẩn non. Sử dụng nước cất vô trùng điều chỉnh độ đục canh khuẩn theo ống Mc Farland 0,5 (tng ng vi (1ữ1,5)ì108 vi khuẩn/ml). Sau đó tiến hành pha loãng thập phân canh khuẩn gốc đến hệ số pha loãng cần thiết cho mỗi nghiên cứu.

3.4.1.3. Khảo sát khả năng kháng B. subtilis của dịch chiết cây bìm bìm a) Khảo sát tính kháng B. subtilis của dịch chiết tươi và dịch chiết

Việc phát hiện ra các hợp chất kháng B. subtilis là điều rất quan trọng. Vì vậy chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng kháng B. subtilis của dịch chiết từ cây

bìm bìm. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá định tính bằng cách xác định

vịng kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán đĩa (Kirby- Bauer method) với các vi sinh vật kiểm định.

Để khảo sát khả năng kháng B. subtilis của dịch chiết, chúng tôi nuôi cấy vi sinh vật kiểm định trong hộp peptri chứa môi trường thạch - pepton - cao nấm men trong 24 giờ ở nhiệt độ 370C. Tại những vị trí đục lỗ thạch được bổ sung 0,2 ml dịch chiết tươi và 0,2 ml dịch chiết đã được ngâm và qua quá trình xử lý. Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật và vòng tròn kháng khuẩn so với mẫu khơng có dịch chiết. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ trên mặt thạch có nhỏ dịch chiết. Chọn hệ số pha loãng là 10-9 để quan sát vịng kháng khuẩn. Sau thời gian ni cấy đo đường kính vịng kháng khuẩn của mỗi đĩa, kết quả thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.3.

Bảng 3.3: Đường kính vịng kháng B. subtilis của dịch chiết

Đĩa Đường kính (mm)

Dịch chiết tươi 24

Dịch cô đặc 21

SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long

Hình 3.3: Hình ảnh vịng kháng B. subtilis của dịch chiết

Kết quả cho thấy trong thời gian 24 giờ nuôi cấy, dịch chiết tươi và dịch chiết được ngâm khuếch tán vào môi trường ức chế sự sinh trưởng và phát triển của B. subtilis tạo thành vịng vơ khuẩn. Dịch chiết tươi kháng B. subtilis và tạo

vịng trịn kháng khuẩn có đường kính 24mm lớn hơn dịch tinh sạch có đường kính 21mm. Điều đó chứng tỏ tính kháng khuẩn sự liên quan đến các hợp chất polyphenol có trong dịch kháng khuẩn. Tuy nhiên tính kháng khuẩn của dịch chiết tươi mạnh hơn nhiều với dịch chiết đã qua ngâm và xử lý.

Để đánh giá chính xác về tính kháng khuẩn của chiết của cây bìm bìm chúng tơi chọn dịch cơ đặc có hàm lượng 60mg/l để tiếp tục nghiên cứu và xác định MIC của dịch chiết đối với B. subtilis.

b) Xác định MIC của dịch chiết cây bìm bìm đối với B. subtilis

Giá trị MIC được xem như là tiêu chuẩn vàng để đánh giá sự nhạy cảm của vi sinh vật với các chất kháng khuẩn. MIC là nồng độ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn ức chế 90% ÷ 99% lượng vi sinh vật trong mẫu sau một thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp. Chọn hệ số pha lỗng 10-9 để đếm khuẩn lạc.

Chuẩn bị dịch chiết: Dịch chiết cơ đặc có hàm lượng 60 mg/ml. Để xác định MIC ta tiến hành pha loãng thành nhiều nồng độ nhỏ hơn theo phương pháp pha loãng gấp đơi. Nồng độ pha lỗng biểu diễn ở bảng 3.4.

Dịch chiết cô đặc sau khi pha lỗng gấp đơi, lần lượt chuyển 2ml dịch đã pha lỗng vào 18ml mơi trường thạch LB-agar đã được vô trùng và đổ vào đĩa petri. Cấy 0,1 ml canh khuẩn non vi khuẩn B. subtilis lên bề mặt thạch bằng phương pháp cấy trang. Sau đó ủ đĩa cho khuẩn lạc xuất hiện và đếm số khuẩn lại tạo thành. Cần chú ý mặt thạch phải khơ để mẫu vi sinh vật dính xuống và lượng mẫu khơng được lấy q 0,1ml, bởi vì lượng mẫu quá lớn sẽ làm cho khuẩn lạc mọc lan khó đếm. Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa song song để đếm khuẩn lạc.

Bảng 3.4: Nồng độ pha lỗng của dịch cơ đặc

Dung dịch kháng khuẩn Nước cất (ml) ^{Độ pha loãng} Nồng độ trung gian (mg/ml) Nồng độ cuối (mg/ml) 2 ml (60 mg/ml) 1,0 ml 0,5 ml 0,5 ml 1,0 1,5 3,5 1/2 1/4 1/8 30 15 7,5 3,0000 1,5000 0,7500 2 ml ( 7,5mg/ml)

1,0 ml 0,5 ml 0,5 ml 1,0 1,5 3,5 1/2 1/4 1/8 3,75 1,875 0,938 0,3750 0,1875 0,0938 2 ml (0,938 mg/ml) 1,0 ml 0,5 ml 0,5 ml 1,0 1,5 3,5 1/2 1/4 1/8 0,459 0,229 0,114 0,0459 0,0229 0,0114 Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ, khuẩn lạc phát triển khá đồng đều, đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa đã nuôi. Đọc kết quả ở đĩa kiểm chứng để trước sau đó đọc ở đĩa có chứa dịch kháng khuẩn và đọc đĩa có nồng độ nhỏ nhất đến đĩa có nồng độ cao dần. Từ kết quả đếm số khuẩn lạc trên các đĩa (bảng 3.5), áp dụng cơng thức (2.2), tính % vi khuẩn chết ở các nồng độ khác nhau như sau:

Ở nồng độ 0,1140mg/ml;

% vi khuẩn chết = (CFU đối chứng – CFU dich cô đặc)/ CFU đối chứng ×100 = (324 - 267) × 100/324= 17,59%;

Ở nồng độ 0,2290 mg/ml;

% vi khuẩn chết = (324 - 203) × 100/324= 37,34%;

Tương tự chúng tơi tính % vi khuẩn chết ở các nồng độ tiếp theo để xác định MIC. Kết quả biểu diễn trên bảng 3.5.

Bảng 3.5: MIC của dịch chiết cô đặc đối với B. subtilis

Thứ tự đĩa ^{Hàm lượng dịch chiết} (mg/ml) Mi (CFU/ml)×107 % vi khuẩn chết 1 0 324 0 2 0,0114 267 17,60 3 0,0229 203 37,35 4 0,0459 145 55,25 5 0,0938 87 73,15 6 0,1875 51 84,26 7 0,3750 26 91,98 8 0,7500 18 94,45 9 1,5000 7 97,84

10 3,0000 0 100

Sau thời gian nuôi 24 giờ ở 37oC nhận thấy ở mẫu chứng (mẫu không bổ sung dịch kháng khuẩn) vi khuẩn vẫn phát triển bình thường, điều đó chứng tỏ sự thuần khiết của chủng vi khuẩn và đảm bảo chúng không bị chết trước khi tiến hành. Số lượng vi khuẩn mọc trên đĩa thạch giảm dần khi nồng độ dịch kháng khuẩn tăng dần và đến mơi trường có nồng độ 1,5mg/ml thì vi khuẩn B. subtilis bị ức chế hoàn toàn. Cũng từ kết qủa bảng 3.5, tại nồng độ 1,5mg/ml dịch chiết có thể ức chế trên 97% vi khuẩn B. subtilis. Như vậy giá trị MIC của dịch cô đặc đối với B. subtilis là 1,5 mg/ml.

3.4.1.4. Khảo sát khả năng kháng Bacillus cereus của dịch chiết thân cây bìm bìm

a) Khảo sát tính kháng B. cereus của dịch chiết tươi và dịch cô đặc

Khả năng kháng B. cereus được thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch và các bước tiến hành tương tự như đối với B. subtilis. Dung dịch kháng khuẩn và canh khuẩn non vi khuẩn kiểm định chuẩn bị như mục 3.3, sử dụng mơi trường LB -agar; chọn độ pha lỗng 10-9 để quan sát vịng kháng khuẩn. Đo đường kính vịng kháng khuẩn của mỗi đĩa, kết quả thể hiện trên bảng 3.6 và hình 3.4.

Bảng 3.6: Đường kính vịng kháng B. cereus của dịch chiết

Đĩa Đường kính (mm)

Dịch chiết tươi 27

Dịch cô đặc 22

SVTH: Nguyễn Văn Hùng Lớp 10SHLT GVHD: TS. Đặng Đức Long

Dịch cơ đặc Dịch chiết tươi

Hình 3.4: Hình ảnh vịng kháng B. cereus của dịch chiết

Từ kết quả trên cho thấy, dịch chiết tươi và dịch cô đặc của thân cây bìm bìm cũng có khả năng kháng vi khuẩn vi khuẩn B. cereus. Dịch chiết có khả năng kháng khuẩn nhờ nó có chứa hàm lượng lớn các hợp chất polyphenol và một số các hợp chất có khả năng kháng khuẩn khác. Các hợp chất này tác động lên bề mặt tế bào, ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào. Ngồi ra dịch chiết có pH thấp nên góp phần làm giảm pH của mơi trường, điều này cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật.

Trên hình 3.4, khuẩn lạc mọc xung quanh cách mép lỗ đục một khoảng là 27 mm và 22 mm đối với dịch chiết tươi và dịch cô đặc. Như vậy dịch chiết tươi có khả năng kháng B. cereus tốt hơn dịch cô đặc. Cũng tương tự như khảo sát với vi khuẩn B. Subtilis, ta chọn dịch chiết cô đặc để xác định MIC.

b) Xác định MIC của dịch chiết cô đặc đối với B. cereus

Dung dịch kháng khuẩn được pha lỗng gấp đơi như ở bảng 3.4, sử dụng môi trường LB –agar và chọn độ pha loãng 10-9 để quan sát vòng kháng khuẩn. Kết quả biểu diễn ở bảng 3.7.

Bảng 3.7: MIC của dịch chiết cô đặc đối với B. cereus

Thứ tự đĩa Hàm lượng dịch chiết (mg/ml) Mi (CFU/ml)107 % vi khuẩn chết 1 0 288 0 2 0,0114 256 11,11 3 0,0229 178 38,19 4 0,0459 119 58,68 5 0,0938 76 73,62

6 0,1875 43 85,07

7 0,3750 24 91,67

8 0,7500 16 94,45

9 1,5000 5 98,26

10 3,0000 0 100

Từ kết quả trên bảng 3.7 nhận thấy tại nồng độ 1,5 mg/ml đã có thể ức chế được 98,26% vi khuẩn B. cereus như vậy MIC của dịch cô đặc đối với B. cereus là 1,5 mg/ml.

So sánh với các kết quả trên, thì khả năng kháng B. subtilis thấp hơn so với

B. cereus.

3.4.1.5. So sánh tính kháng khuẩn của dịch chiết đối với 2 vi sinh vật kiểm định

Để so sánh tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thân cây bìm bìm với chủng VSV kiểm định chúng tơi biểu diễn kết quả trên hình 3.6.

Hình 3.6: Biểu đồ biểu diễn khả năng kháng khuẩn của dịch chiết đối với các vi sinh vật kiểm định

Kết quả nghiên cứu trên hình 3.6 cho thấy dịch chiết cây bìm bìm có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật trên. Trong cùng một điều kiện thí nghiệm, tính kháng khuẩn của dịch chiết tươi lớn hơn dịch cơ đặc (trong dịch cịn chứa nhiều hợp chất khác như: quecertin, tinh dầu, saponin, hibiscin, flavonoids,

các axit hữu cơ… mà các chất này cũng có khả năng kháng khuẩn). Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá thơng qua đường kính vịng kháng khuẩn và MIC của mỗi thí nghiệm.

Tính kháng khuẩn của dịch chiết đối với mỗi loại vi sinh vật là khác nhau và giảm dần theo thứ tự: B. cereus; B. subtilis. Nguyên nhân sự khác nhau là do bề dày màng tế bào của mỗi loại khác nhau, do đó tính thấm của dịch chiết qua màng cũng khác nhau. Mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì khả năng thích nghi của chúng cũng khác nhau, khi có sự biến đổi của mơi trường ni cấy. Đặc biệt là tính kháng khuẩn của dịch chiết còn phụ thuộc vào hàm lượng và các loại chất tan có trong dịch cũng như bản chất của các loại dung môi sử dụng.

Từ kết quả nghiên cứu mục 3.4.1 (trong phạm vi khảo sát) chúng tơi có một số nhận xét như sau:

- Dịch chiết từ cây bìm bìm có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram dương (B. cereus, B. subtilis);

- Tính kháng của dịch chiết đối với 2 loại vi khuẩn kiểm định giảm dần

B. cereus; B. Subtilis;

- Dịch chiết tươi có tính kháng khuẩn tốt hơn dịch chiết cơ đặc ở cùng một nồng độ.

3.3.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thân cây bìm bìm

Để hiểu rõ đặc tính sinh học của cây bìm bìm trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết được thu nhận từ thân cây bìm bìm và so sánh với chất chống oxy hóa thơng dụng như vitamin C. Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định hoạt độ kháng oxy hóa của antho như: phương pháp Blagdorov, phương pháp axit thiobarbituric (TBA) phương pháp iod, phương pháp thiocyanate (TC)... Nhưng một số nghiên cứu thì phương pháp TC đơn

giản và cho độ chính xác cao, nội dung phương pháp được trình bày ở mục 2.2.5.2. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn Tween 80 làm cơ chất, các chất chống oxy hóa được bổ sung với hàm lượng 60 mg/l và tiến hành làm 4 thí nghiệm. Các thí nghiệm được tiến hành như sau:

- Hút 6ml Tween 80 hịa tan trong 6ml ethanol sau đó lần lượt cho vào 4 bình định mức 25 ml;

- Bình 1: cho 1 ml dung dịch vitamin C nồng độ 1,5 mg/l;

- Bình 2: cho 1 ml dịch chiết tươi có hàm lượng chất khơ là 4 mg/ml; - Bình 3: cho 450 µl dịch chiết có hàm lượng chất khơ là 6,2 mg/ml; - Bình 4: cho 1 ml nước cất (mẫu trắng);

- Định mức hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch đệm phosphat có pH = 7 lên đến thể tích 25ml để tất cả các bình đều đạt nồng độ chất chống oxy hóa là 60 mg/l;

- Tiến hành phản ứng trong bóng tối ở nhiệt độ 370C trong 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ;

- Sau thời gian phản ứng lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch phản ứng trên và thêm 6 ml ethanol 75%;

- Ống thứ nhất cho 1ml FeSO4 0,02 M, ống thứ 2 thay FeSO4 bằng nước cất (dùng để cân bằng dung dịch trống);

- Sau 5 phút thêm 1 ml NH4SCN bão hòa, lắc đều;

- Đo độ hấp thụ trên máy so màu tại bước sóng λmax = 500 nm [9], [17], A0 là độ hấp thụ của của mẫu trắng; At là độ hấp thụ của mẫu thử;

- Phần trăm ức chế oxy hóa (Hd) được xác định theo công thức 3.1. .100% Ao At Ao Hd ₌ − (3.1) Trong đó: Ao, At, Hd lần lượt là độ hấp thụ của mẫu trắng, độ hấp thụ của mẫu thử, phần trăm ức chế oxy hóa.

- Kết quả biểu diễn trên bảng 3.8 và hình 3.7.

Từ kết quả hình 3.7 ta có thể khẳng định dịch chiết thân cây bìm bìm có khả năng kháng oxy hóa mạnh. Các chất polyphenol trong dịch chiết có khả năng nhận các gốc tự do sinh ra trong quá trình khơi mào, tạo ra các gốc ArO* bền vững kém hoạt động.

Trong phạm vi khảo sát, khả năng ức chế oxy hóa của vitamin C là cao nhất, sau đó đến dịch chiết tươi và cuối cùng là dịch chiết được xử lý. Sau 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ khảo sát, chúng tơi thấy cả 3 chứa chất chống oxy hóa đều có khả năng ức chế oxy hóa giảm theo thời gian, trong đó dung dịch vitamin C là khá ổn định,

còn dịch chiết giảm khá nhanh. Điều này được giải thích như sau: khả năng ức chế oxy hóa phụ thuộc khá nhiều vào bản chất chống oxy hóa. Đặc biệt nó phụ thuộc vào năng lượng liên kết của ion H+ trong nhóm hydroxyl OH của các hợp chất polyphenol. Trong đó, vitamin C có năng lượng liên kết của nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl là rất bé nên dễ dàng nhường H+ cho các peroxyt, tiếp đến là vitamin C và cuối cùng là dịch chiết hỗn hợp từ cây bìm bìm.

Hình 3.7: Độ hấp thụ ở bước sóng 500nm của các chất chống oxy hóaBảng 3.8. Đợ hấp thụ của các chất chống oxy hóa