2.2.1. Phương pháp phân lập
Lấy mẫu đất, đặc biệt ở những nơi có nhiều mùn, nhiều mẫu động thực vật thối giữa, hòa nước thành dịch nước đất (lấy một ít đất khoảng 10g và 90ml nước vô trùng cho vào bình tam giác 250ml).
Dùng kéo cắt ngắn cỏ khô hơi mục khoảng 1cm, cho vào bình tam giác, cho dịch đất xâm xấp cỏ khô, có thể rắc thêm một ít bột CaCO3 lên bề mặt cỏ. Gia nhiệt tới 850C, giữở nhiệt độ này trong 10 – 15 phút. Các bình tam giác sau khi gia nhiệt ở 850C được nút bông và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 320C trong 2 – 3 ngày đêm. Theo dõi sẽ thấy một lớp váng nhày trên bề mặt cỏ, lấy lớp váng này cấy ra đĩa petri trên bề mặt môi trường phân lập theo phương pháp pha loãng tới hạn và chọn các khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng.
Với khoai tây, không gọt vỏ, được cắt thành những thỏi dài có kích thước 0,5 × 0,5 × 3 cm đặt vào các hộp petri. Thêm dịch đất đã ra nhiệt ở 850C, có thể thêm một ít bột CaCO3 rắc lên thỏi khoai tây. Đặt đĩa có khoai tây vào tủ ấm ở 320C trong 2 ngày. Trên bề mặt thanh khoai tây hình thành lớp màng nhăn nheo, lấy màng này cấy ra môi trường phân lập trong đĩa petri.
2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống, ở trong ống nghiệm.
Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 340C, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống.
Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn
Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc.
2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường NA: Khả năng phát triển của khuẩn lạc
Bề mặt khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc
2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống
Loại tiêu bản này dùng để xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp các tế bào, khả năng hình thành bào tử, khả năng chuyển động.
Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên giữa phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật mọc trên môi trường đặc, đặt vào chỗ giọt nước trên phiến kính, hòa nhẹ để tạo huyền phù. Đậy nhẹ lá kính, vừa đậy vừa kéo trên giọt dịch để tránh tạo thành bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô.
Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau đó đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật kính 40X [7].
2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet, Metyl violet) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn như vậy gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy gọi là vi khuẩn Gram âm.
Cách tiến hành: Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa vào giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Để giọt nước bay hơi dần như vậy vi khuẩn sẽ bị gắn chặt vào phiến kính.
Nhuộm màu bằng tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc tím này lên vết bôi, giữ 1 –2 phút rồi rửa bằng nước cất.
Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút cho đến khi thẫm lại
Đổ hết thuốc nhuộm đi và lại tráng bằng nước cất. Sau đó nhúng vào dung dịch cồn 960 trong 30 – 40 giây.
Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi.
Nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng trong 1 – 2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô. Sau đó đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thi đó là vi khuẩn Gram dương. Nếu vi khuẩn nhuộm màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm.
2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử
Để xác định sự hình thành bào tử của vi khuẩn chúng tôi tiến hành theo phương pháp sốc nhiệt:
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối tế bào được hòa vào nước cất.
Sốc nhiệt ở 80 – 850C trong 15 phút
Sau khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm 340C trong 24h. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Nếu chủng vi khuẩn nào sinh enzyme catalase sẽ tạo thành bọt khí trên phiến kính.
2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm )
Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. Do vi sinh vật trong phần lớn trường hợp là không có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch nuôi cấy của tế bào hấp phụ ánh sáng không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được. Trong giới hạn nhất định, số lượng ánh sáng bị tán xạ do dịch nuôi cấy vi sinh vật tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Nên trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào mà sự tán xạ ánh sáng càng nhiều nghĩa là môi trường càng đục tương đương với mật độ tế bào vi sinh vật càng nhiều.
Lấy 3 ml dịch nuôi cấy để tiến hành đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy quang phổ kế với đối chứng là môi trường không chứa vi khuẩn.
2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein
Để xác định khả năng thủy phân tinh bột, protein của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch.
Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên các môi trường lỏng chứa cazein, tinh bột ở nhiệt độ phòng ( 30 – 320C) trên máy lắc tốc độ 125 vòng/ phút. Sau 36h lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng.
Tiếp theo, đổ môi trường đặc có chứa tinh bột, cazein đã được khử trùng vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng.
Dùng pipetman hút dịch đã được lọc nhỏ vào các giếng trong đĩa petri. Để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch khuyếch tán đều. Sau đó để vào tủ ấm ở nhiệt độ 340C.
Sau khoảng 24h thử bằng thuốc thử. Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt thạch, nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng.
Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của các enzyme amylase, protease, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các enzyme này nhanh và đơn giản.
Kiểm tra hoạt tính Protease trên môi trường chứa cazein:
Dùng thuốc thử HgCl2 1% đổ lên bề mặt môi trường nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa phân giải sẽ có màu trắng đục mờ.
Kiểm tra hoạt tính Amylase trên môi trường chứa tinh bột tan: Dùng dung dịch Lugol đổ lên môi trường nuôi cấy chứa tinh bột. Vùng chưa bị phân giải có màu xanh mực, phần xung quanh giếng bị phân giải trở thành trong suốt không màu.
Đánh giá khả năng sinh enzyme để tuyển chọn những chủng có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D). (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao ( d là đường kính giếng, d = 1cm).
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM
Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau:
1.Tinh bột tan với các nồng độ 1,5 ; 2 và 2,5% 2.Cazein với các nồng độ 2, 3, và 4%
3.Bột đậu tương với các nồng độ 1, 2, 3 và 4% 4.CaCO3 với các nồng độ 1, 2, 3, và 4%
Cho 50 ml môi trường vào bình tam giác khử trùng ở 1 atm/ 30 phút, để nguội sau đó cấy chủng có hoạt tính protease, amylase với tỷ lệ 1 – 2%. Sau đó lắc ở 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD620nm và pH ở các thời điểm khác nhau để đánh giá sự sinh trưởng của các chủng.
Sau mỗi lần đo lấy 0,5 ml dung dịch vi khuẩn nhỏ vào các lỗ thạch có chứa cơ chất cảm ứng để nuôi trong tủ ấm 340C, trong 24 giờ. Xác định khả năng phân hủy của các chủng bằng thuốc thử sau đó đo vòng phân giải của chúng.
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM
Chuẩn bị các môi trường lỏng NA vào trong các bình tam giác như nhau với các độ thông khí khác nhau là 10, 20, 30, 40%. Và các môi trường lỏng NA với các độ thông khí khác nhau như trên nhưng có bổ sung 1% CaCO3. Các môi trường đều được khử trùng ở 1atm / 30 phút. Để nguội, sau đó cấy mỗi chủng vào mỗi loại môi trường, đem lắc 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ đem đo OD620nm để xác định khả năng sinh trưởng của các chủng.
Phần III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Phân lập chủng Bacillus
Từ các mẫu cỏ khô, khoai tây và đất vườn, chúng tôi đã phân lập được 3 khuẩn lac, tạm kí hiệu là:
Từ cỏ khô và đất phân lập được chủng kí hiệu là Bs và Bm Từ khoai tây và đất phân lập được chủng kí hiệu là BM
3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các khuẩn lạc được làm sạch thuần khiết bằng cách cấy phân lập và cấy lại nhiều lần. Sau đó đem quan sát thấy các khuẩn lạc có hình dạng khác nhau: Chủng Bs khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành màng mịn lan trên bề mặt thạch, đường kính 2 – 3mm.
Chủng Bm có khuẩn lạc tròn, lồi ở giữa, màu trắng đục, mép trơn, đường kính 2 – 3 mm.
Chủng BM khuẩn lạc màu xám nhạt, không lan ra môi trường, đường kính 2 – 3 mm.
Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm
Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM
3.3. Đặc điểm hình thái tế bào
Các chủng Bs, Bm, BM được làm tiêu bản sống và quan sát trên kính hiển vi ta thấy là trực khuẩn hình que, chuyển động, kích thước từ 3 – 5
µm, Bm có kích thước tế bào lớn hơn cả, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi dài hay ngắn khác nhau.
Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy cả 3 chủng đều bắt màu tím, tức cả 3 chủng đều là vi khuẩn Gram dương.
Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs
Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm
Qua nghiên cứu hình thái khuẩn lạc và tế bào chúng tôi sơ bộ bước đầu định tên cho 3 chủng này như sau: Bs – Bacillus subtilis, Bm – Bacillus megatherium, BM – Bacillus mesentericus.
3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với cả 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu: Cấy từng chủng vi khuẩn ra đĩa và nuôi trong tủ ấm ở 340C. Sau khi thấy khuẩn lạc mọc lên thì nhỏ lên khuẩn lạc một giọt H2O2 10%. Kết quả cho thấy ở khuẩn lạc của cả 3 chủng đều có phản ứng dương tính với thuốc thử. Điều này chứng tỏ cả 3 chủng Bs, Bm, BM đều có khả năng tạo enzyme catalase và như vậy chúng là những chủng vi khuẩn hiếu khí.
2 H2O2 2 H2O + O2
Phản ứng dương tính được nhận thấy ở trên chính là do các phân tử oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí chứng tỏ cả hai chủng này đều có hoạt tính catalase phân hủy H2O2 và giải phóng oxy. Chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng máy lắc: bình trụ 250 ml chứa
50 ml môi trường được bổ sung một vòng que giống đưa đi lắc ở 125 vòng/ phút trong 24 – 36 giờ.
3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM ba chủng Bs, Bm và BM
Ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường đặc: môi trường thạch - tinh bột, môi trường thạch - cazein. Để thử hoạt tính enzym chúng tôi thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch. Nhỏ dịch nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có cơ chất cảm ứng và đã được lọc vi khuẩn vào giếng, sau 35 giờ tiến hành thử thuốc thử theo dõi xem có vùng phân giải xung quanh giếng không và đo đường kính phân giải của các enzym quanh giếng. Kết quả đo thể hiện ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra: Môi trường Chủng (D – d) mm Enzym thuỷ phân
Bs 9 Amylase Bm 8 Amylase Tinh bột BM 10 Amylase Bs 17 Protease Bm 15 Protease Cazein BM 15 Protease (d là đường kính giếng, d = 10 mm)
Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy, cả 3 chủng đều có khả năng sinh enzym amylase, protease. Trong đó, đường kính phân giải ở môi trường cazein lớn hơn. Có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau hoặc hoạt tính enzym protease cao, hoặc lượng enzym vi khuẩn sinh ra nhiều, chúng tôi đưa ra điều kiện để nghiên cứu tiếp. Ở đây chúng tôi mới định tính của các enzym amylase, protease. Vậy 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm, BM đều có khả
năng sinh enzym amylase và protease, đây là cơ sở cho việc sản xuất enzym công nghiệp để ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau.
Hoạt tính protease Hoạt tính amylase Chủng Bs Chủng Bs Chủng BM Chủng BM Chủng Bm Chủng Bm
Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM
Từ các thí nghiệm trên tôi thấy, 3 chủng nghiên cứu Bs, Bm, BM là 3 chủng đều có khả năng sinh enzym amylase, protease trên môi trường có cơ
chất cảm ứng. Khi các chủng này gặp môi trường chứa tinh bột, cazein chúng sẽ phát huy tác dụng của nó là sinh ra các enzym tương ứng để phân huỷ các cơ chất này. Hơn nữa, chúng dễ nuôi cấy, để tồn tại trong môi trường đất, nước, nhất là những nơi chứa nhiều chất hữu cơ.
3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng trên môi trường không có chất cảm ứng
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với môi trường lỏng NA. Mỗi chủng giống được cấy vào trong các bình trụ chứa 40ml môi trường với lượng như nhau, nuôi lắc với vận tốc 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Cứ sau 6 giờ
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});